Science Advances：余俊等揭示人源分离酶的底物识别机制

细胞分裂是生命活动的基础生理过程，其核心任务是将复制后的遗传物质准确分配给子代细胞。姐妹染色单体粘连（sister chromatid cohesion）由粘连蛋白（cohesin）复合物介导，是染色体准确分离的重要基础。粘连的建立、维持和及时移除过程若异常，将会导致基因组不稳定性，并与癌症、生殖障碍等疾病的发生发展密切相关。在细胞分裂的 S 期，染色体粘连在 DNA 复制过程中建立；在分裂前期，染色体臂端粘连被 Pds5-Wapl 复合物移除。进入分裂后期时，被激活的分离酶（separase，一种半胱氨酸蛋白酶）通过特异性切割 cohesin 的 SCC1/RAD21 亚基触发染色体的分离。由于分离酶是启动染色体分离的唯一蛋白酶，其活性受到多层次严格调控。主要包括三个层面：1）在细胞分裂后期之前，分离酶活性被抑制因子 securin 和 CDK1-cyclin B 激酶的抑制（详见：Nature：余俊等解析细胞分裂时染色体稳健分离的分子机制）；2）在向分裂后期过渡时，抑制因子被 APC/C (Anaphase-promoting complex/cyclosome）介导的泛素化途径降解，从而激活分离酶；3）在底物层面，染色体 DNA 或底物磷酸化修饰等调控分离酶对底物的切割效率。

分离酶对底物切割发生在保守的 ExxR 基序中精氨酸（R）残基之后。嗜热性杆菌分离酶蛋白酶结构域（SPD）结合 Scc1 多肽（包含ExxR基序）的晶体结构首次揭示该酶识别切割位点的分子机制。长期以来的研究认为，人源 SCC1 蛋白存在两个切割位点，即 R172 （位点1）和 R450 （位点2）。尽管 SCC1 乃至整个蛋白组中存在许多 ExxR 基序，但其中绝大多数并不能被分离酶切割，这表明需要额外的序列或结构特征介导底物的特异性识别与切割。

此外，底物的磷酸化对分离酶的切割活性具有重要调控作用：不仅能显著增强切割效率，甚至是切割发生的决定性因素。在 SCC1 中，多位点磷酸化可显著提高位点1的切割效率，也直接决定位点 2 是否被有效切割。其他底物如 Rec8，Meikin 和 PCNT 的切割同样依赖于多位点磷酸化修饰。然而，分离酶如何特异性识别这些磷酸化位点的分子机制，目前尚不清楚。

Cohesin 由四个核心亚基（SMC1、SMC3、SCC1 和 SA1/SA2）组成，形成一个环形蛋白复合物。对于分离酶如何特异性识别整个 cohesin 复合物这一关键问题，目前尚无明确线索；此外，除 SCC1 之外的其他亚基是否以及如何调控分离酶的切割活性特异性，亦有待进一步阐明。

近日，瑞士日内瓦大学余俊博士（Andreas Boland 团队）在 Science Advances 期刊发表了题为：Substrate recognition by human separase 的研究论文。

该研究通过结合生物化学、结构生物学与交联质谱技术（cross-linking mass spectrometry），系统揭示人源分离酶特异性识别和切割粘连蛋白及其自切割位点的分子机制。

研究团队首先通过底物切割实验确认了 SCC1 的两个切割位点：位点 1 为 R172，而位点 2 实为 R427，并非之前报道的 R450。为了揭示分离酶识别底物的分子机制，研究团队系统解析了分离酶在 apo 状态（捕捉自切割状态）及底物结合状态下（包括切割位点1 和2）的冷冻电镜结构。针对分离酶与底物低亲和力或瞬时相互作用难题，研究团队对分离酶进行蛋白质工程改造：1）将分离酶活性中心 Cys2029 突变为 Ser，防止底物被切割；2）将包含切割位点 1 或 2 的 SCC1 片段融合到分离酶的 Insert 2 区域（一段柔性loop），并移除自切割位点；3）移除自抑制环 loop 1（AIL1），防止竞争性结合；4）用 PLK1 磷酸化融合蛋白，进一步增强分离酶与 SCC1 的亲和力。

结构分析和生化实验表明，包括分离酶自切割位点和 SCC1 在内的底物，通过多个保守基序（[S/D/E]FExxR，Lxx[S/D/E] 和 FF motifs）与分离酶相互作用。分离酶表面至少存在 5 个磷酸基团结合位点 （P-sites），作为对接位点特异性识别磷酸化底物。这一发现为深入理解磷酸化修饰调控分离酶切割活性的机制提供了重要结构基础。

更有趣是，研究团队发现，cohesin 亚基 SA1/SA2 可特异性调控分离酶对 SCC1 位点 2 的切割。为了探究背后的分子机理，研究团队解析了分离酶结合 SCC1-SA2 亚复合物的高分辨率结构，揭示了分离酶、SCC1 和 SA2 之间从未被发现的相互作用界面。具体而言，分离酶的蛋白酶结构域（SPD）、SCC1 位点 2 附近的一段短 α 螺旋及 SA2（C端）的多个 α 螺旋共同形成了一个“三明治夹层”结构。该结构通过介导多重疏水与静电相互作用，稳定了 SCC1 位点 2 在活性中心的结合构象，从而有效促进该位点的切割反应。

最后，研究团队结合交联质谱和冷冻电镜技术，进一步解析 cohesin 的 SMC1/3 亚基与分离酶N端结构域相互作用，为理解分离酶如何特异性识别整个 cohesin 复合物提供了重要线索。

总的来说，该研究系统解析了分离酶在 apo 及底物结合状态下的高分辨率结构，结合生化分析结果，确定并修正了长期沿用的 SCC1 切割位点，并深入揭示了远离切割位点的底物基序及磷酸化位点的识别机制。此外，研究阐明了 cohesin 亚基 SA1/SA2 与分离酶的相互作用，以及其调控分离酶特异性切割 SCC1 位点 2 的机理。基于交联质谱与冷冻电镜结构分析，研究团队提出了分离酶靶向识别整个 cohesin 的分子模型。该研究将我们对分离酶底物识别机制的理解提升到新的高度。

瑞士日内瓦大学余俊博士和 Sophia Schmidt 为该论文的共同第一作者，余俊博士和 Andreas Boland 教授为论文共同通讯作者。Science Advances 杂志同期发表了 Francis Crick 研究所 Frank  Uhlmann 研究员等的点评文章。