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细胞外囊泡检测新突破!Anal Chem:免疫磁珠结合mRNA定量技术灵敏度远超传统方法,为疾病诊断添利器

来源:生物谷原创 2025-07-22 13:19

本研究发现细胞外囊泡内的信使核糖核酸可作为理想标志物,建立的免疫磁珠细胞外囊泡信使核糖核酸定量聚合酶链反应方法,富集和检测灵敏度显著高于现有方法,为相关研究和疾病诊断提供有力工具。

在我们的身体里,细胞之间时刻都在进行着精密的“信息交流”,而细胞外囊泡(EVs)就是这些信息的重要传递者。它们像一个个包裹着各种生物分子的“小信封”,在细胞外环境中穿梭,不仅在细胞间通讯中扮演关键角色,还在疾病诊断和治疗领域展现出巨大潜力。然而,由于缺乏简单高效、技术门槛低的EVs富集和分析方法,其广泛应用仍面临不小挑战。近期,发表在Anal Chem的一项研究iMEMQ: Sensitive and Versatile Detection for Extracellular Vesicles via Immunomagnetic EVs' mRNA qPCR为解决这一难题带来了新的突破。

该研究首先对EVs内各类核酸分子的分布特征进行了系统性探究。结果发现,EVs内部的mRNA是理想的检测标志物,而外部的DNA则不适合。这是因为研究通过一系列实验证实,mRNA主要存在于EVs内部,受到完整膜结构的保护,能避免被RNase降解;而DNA则主要位于EVs外部,易受环境中游离DNA的影响。以常见的β-肌动蛋白和在胰腺癌中常发生突变的KRAS基因为例,β-肌动蛋白在EVs内部的mRNA水平显著高于外部的DNA水平,这为后续的检测提供了可靠的分子靶点。

基于这一发现,研究团队整合上游免疫磁珠捕获技术,建立了免疫磁珠EVs的mRNA定量聚合酶链反应(iMEMQ)方法,实现了EVs富集与分析的一体化流程。

图 1:免疫磁珠捕获细胞外囊泡的实验方案、验证及电镜图像

在检测灵敏度方面,iMEMQ表现出显著优势。与酶联免疫吸附试验(ELISA)相比,其对CD9的检测灵敏度高出260.0倍,对EVs中EphA2的检测灵敏度更是达到775.6倍;与免疫PCR相比,对CD9的检测灵敏度也高出53.9倍。具体来看,对于PANC-1细胞来源的EVs整体群体,mRNA-qPCR的定量限低至2.05×10⁵个颗粒/mL,而ELISA和免疫PCR的定量限分别为2.00×10⁷个颗粒/mL和3.40×10⁶个颗粒/mL,mRNA-qPCR的灵敏度约为ELISA的98倍、免疫PCR的16.7倍。针对不同的EV亚群,如CD9⁺、CD63⁺、CD81⁺EVs,mRNA-qPCR同样展现出更高的灵敏度,分别是相应ELISA检测的23.4倍、19.2倍、66.1倍,是相应免疫PCR检测的9.1倍、7.6倍、13.0倍。对于来自正常胰腺导管上皮细胞HPNE的EVs整体群体,mRNA-qPCR的灵敏度优势更为明显,达到CD9-ELISA的622.6倍。

图 2:PANC-1细胞外囊泡中核酸分子的分布及相关分析

在特定目标蛋白阳性EVs(POI⁺EVs)的分析中,iMEMQ的优势进一步凸显。以胰腺癌相关的EphA2⁺EVs为例,采用iMEMQ方法(即特异性捕获EphA2⁺EVs结合mRNA-qPCR检测),与其他策略相比,灵敏度最高可提升775.6倍。这对于检测那些在正常细胞分泌的EVs背景中占比极低的疾病相关EVs来说,意义重大,能更精准地捕捉到疾病信号。

图 3:不同方法对细胞外囊泡及亚群的检测灵敏度对比

同时,iMEMQ在血浆样本中的应用也得到了验证。其具有出色的特异性,抗体对EVs的捕获能被相应蛋白完全阻断,不受其他蛋白干扰。在健康供体的EDTA血浆中,CD9⁺和CD63⁺EVs占比较高,分别约为69%和63%,而CD81⁺EVs占比仅约14%。并且,iMEMQ对EVs的富集效率极高,超过98%。通过分析还发现,血浆中高比例的EVs同时表达CD9和CD63,CD9和CD81的重叠较少,CD63和CD81则有相对较高的共定位。在疾病相关EVs的检测中,iMEMQ也表现出良好的可行性。在B16-F10黑色素瘤荷瘤小鼠模型中,能检测到PD-L1⁺EVs的水平显著高于对照组;在BxPC-3胰腺癌荷瘤小鼠模型中,EphA2⁺EVs和TROP2⁺EVs的水平也显著高于非荷瘤小鼠,充分证明了其在疾病相关EVs分析中的应用潜力。

总的来说,这项研究通过明确EVs内核酸分子的分布特征,建立了iMEMQ这一高灵敏度、高特异性且操作简便的EVs富集与分析方法。它不仅为EVs的基础研究提供了有力工具,更在疾病诊断领域展现出广阔前景。随着这一技术的不断完善和应用,未来我们或许能通过对EVs的精准检测,更早地发现疾病踪迹,为疾病的诊断和治疗带来新的突破,让我们在对抗疾病的道路上更具主动权。(生物谷Bioon.com)

参考文献:

Li C, He S, Ding Y, et al. iMEMQ: Sensitive and Versatile Detection for Extracellular Vesicles via Immunomagnetic EVs' mRNA qPCR. Anal Chem. Published online July 17, 2025. doi:10.1021/acs.analchem.5c01470

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