细胞外囊泡检测新突破！Anal Chem：免疫磁珠结合mRNA定量技术灵敏度远超传统方法，为疾病诊断添利器
来源：生物谷原创 2025-07-22 13:19
本研究发现细胞外囊泡内的信使核糖核酸可作为理想标志物，建立的免疫磁珠细胞外囊泡信使核糖核酸定量聚合酶链反应方法，富集和检测灵敏度显著高于现有方法，为相关研究和疾病诊断提供有力工具。
在我们的身体里，细胞之间时刻都在进行着精密的“信息交流”，而细胞外囊泡（EVs）就是这些信息的重要传递者。它们像一个个包裹着各种生物分子的“小信封”，在细胞外环境中穿梭，不仅在细胞间通讯中扮演关键角色，还在疾病诊断和治疗领域展现出巨大潜力。然而，由于缺乏简单高效、技术门槛低的EVs富集和分析方法，其广泛应用仍面临不小挑战。近期，发表在Anal Chem的一项研究iMEMQ: Sensitive and Versatile Detection for Extracellular Vesicles via Immunomagnetic EVs' mRNA qPCR为解决这一难题带来了新的突破。
该研究首先对EVs内各类核酸分子的分布特征进行了系统性探究。结果发现，EVs内部的mRNA是理想的检测标志物，而外部的DNA则不适合。这是因为研究通过一系列实验证实，mRNA主要存在于EVs内部，受到完整膜结构的保护，能避免被RNase降解；而DNA则主要位于EVs外部，易受环境中游离DNA的影响。以常见的β-肌动蛋白和在胰腺癌中常发生突变的KRAS基因为例，β-肌动蛋白在EVs内部的mRNA水平显著高于外部的DNA水平，这为后续的检测提供了可靠的分子靶点。
基于这一发现，研究团队整合上游免疫磁珠捕获技术，建立了免疫磁珠EVs的mRNA定量聚合酶链反应（iMEMQ）方法，实现了EVs富集与分析的一体化流程。
图 1：免疫磁珠捕获细胞外囊泡的实验方案、验证及电镜图像
在检测灵敏度方面，iMEMQ表现出显著优势。与酶联免疫吸附试验（ELISA）相比，其对CD9的检测灵敏度高出260.0倍，对EVs中EphA2的检测灵敏度更是达到775.6倍；与免疫PCR相比，对CD9的检测灵敏度也高出53.9倍。具体来看，对于PANC-1细胞来源的EVs整体群体，mRNA-qPCR的定量限低至2.05×10⁵个颗粒/mL，而ELISA和免疫PCR的定量限分别为2.00×10⁷个颗粒/mL和3.40×10⁶个颗粒/mL，mRNA-qPCR的灵敏度约为ELISA的98倍、免疫PCR的16.7倍。针对不同的EV亚群，如CD9⁺、CD63⁺、CD81⁺EVs，mRNA-qPCR同样展现出更高的灵敏度，分别是相应ELISA检测的23.4倍、19.2倍、66.1倍，是相应免疫PCR检测的9.1倍、7.6倍、13.0倍。对于来自正常胰腺导管上皮细胞HPNE的EVs整体群体，mRNA-qPCR的灵敏度优势更为明显，达到CD9-ELISA的622.6倍。
图 2：PANC-1细胞外囊泡中核酸分子的分布及相关分析
在特定目标蛋白阳性EVs（POI⁺EVs）的分析中，iMEMQ的优势进一步凸显。以胰腺癌相关的EphA2⁺EVs为例，采用iMEMQ方法（即特异性捕获EphA2⁺EVs结合mRNA-qPCR检测），与其他策略相比，灵敏度最高可提升775.6倍。这对于检测那些在正常细胞分泌的EVs背景中占比极低的疾病相关EVs来说，意义重大，能更精准地捕捉到疾病信号。
图 3：不同方法对细胞外囊泡及亚群的检测灵敏度对比
同时，iMEMQ在血浆样本中的应用也得到了验证。其具有出色的特异性，抗体对EVs的捕获能被相应蛋白完全阻断，不受其他蛋白干扰。在健康供体的EDTA血浆中，CD9⁺和CD63⁺EVs占比较高，分别约为69%和63%，而CD81⁺EVs占比仅约14%。并且，iMEMQ对EVs的富集效率极高，超过98%。通过分析还发现，血浆中高比例的EVs同时表达CD9和CD63，CD9和CD81的重叠较少，CD63和CD81则有相对较高的共定位。在疾病相关EVs的检测中，iMEMQ也表现出良好的可行性。在B16-F10黑色素瘤荷瘤小鼠模型中，能检测到PD-L1⁺EVs的水平显著高于对照组；在BxPC-3胰腺癌荷瘤小鼠模型中，EphA2⁺EVs和TROP2⁺EVs的水平也显著高于非荷瘤小鼠，充分证明了其在疾病相关EVs分析中的应用潜力。
总的来说，这项研究通过明确EVs内核酸分子的分布特征，建立了iMEMQ这一高灵敏度、高特异性且操作简便的EVs富集与分析方法。它不仅为EVs的基础研究提供了有力工具，更在疾病诊断领域展现出广阔前景。随着这一技术的不断完善和应用，未来我们或许能通过对EVs的精准检测，更早地发现疾病踪迹，为疾病的诊断和治疗带来新的突破，让我们在对抗疾病的道路上更具主动权。（生物谷Bioon.com）
参考文献：
Li C, He S, Ding Y, et al. iMEMQ: Sensitive and Versatile Detection for Extracellular Vesicles via Immunomagnetic EVs' mRNA qPCR. Anal Chem. Published online July 17, 2025. doi:10.1021/acs.analchem.5c01470
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