《自然》：免疫治疗的黄金时间段找到了！科学家发现，DC和T细胞也是“日出而作日入而息”，上午开展免疫治疗效果更好

免疫系统是抗肿瘤的主力军，它通过复杂的防御机制消除或遏制肿瘤细胞的生长，为生命健康保驾护航[1]。但是你知道吗，免疫系统也不是时刻备战的，它也是个需要休息，才能好好工作的“打工仔”。

前期已有研究表明，先天性免疫和获得性免疫均表现出24小时昼夜节律性反应[2-4]，在经过初始刺激数周后，免疫效应仍然会节律性地在一天中某个时段产生[5, 6]。此外，昼夜节律的破环会促进肿瘤的进展[7]。然而，免疫系统的节律性对肿瘤的监测和免疫治疗有效性的影响，仍然是未知的。

近日，日内瓦大学Christoph Scheiermann教授研究团队揭示了免疫系统的节律性，尤其是树突状细胞（DCs）的节律性，对肿瘤的生长和免疫治疗的有效性具有极大的影响，这预示着根据免疫系统的节律性改变给药时间点可以在很大程度上提高治疗效果。相关研究已在《自然》杂志上发表[8]。

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首先，研究人员在一天中六个不同的时段：授时因子时间（ZT，时间生物学相关的实验所制定的环境时间）的早上（ZT1），中午（ZT5），下午（ZT9），晚上（ZT13），午夜 (ZT17)和凌晨（ZT21），给小鼠皮下接种B16-F10黑色素瘤细胞，并观察两周内肿瘤细胞的生长情况。

结果表明，肿瘤体积大小明显受接种的时间影响，凌晨接种的小鼠肿瘤体积较大，下午和晚上接种的小鼠肿瘤体积较小。同时，对于乳腺癌原位肿瘤模型（E0771和4T1）和鼠结肠癌肿瘤模型（MC-38）来说，与黑色素瘤的结果相似。说明无论肿瘤类型和接种部位如何，接种时间对肿瘤大小的影响都是相同的。

为了验证这种节律性与免疫系统有关，研究人员利用同时缺失获得性免疫和先天性免疫的NSG小鼠，以及缺失获得性免疫的Rag2-/-小鼠进行实验。结果发现，上述接种时间带来的差异性不复存在，说明的确是免疫系统的节律性造成了肿瘤大小的差异。

不同时间接种肿瘤后小鼠肿瘤体积大小变化

随后，利用流式细胞术，研究人员评估了接种肿瘤后第14天时，小鼠肿瘤组织种免疫细胞的浸润情况。

结果显示，小鼠体内CD8+T细胞的数量依赖于肿瘤接种时间，下午接种肿瘤细胞，CD8+T细胞数量达到了峰值，而在凌晨接种，CD8+T细胞的数量则急剧减少。利用CD8+T特异性抗体耗竭CD8+T细胞后，小鼠肿瘤体积增加。这些结果说明，CD8+T细胞是节律性地发挥着抗肿瘤作用。

不同时段CD8+T细胞的浸润情况，以及耗竭CD8+T细胞后肿瘤的生长情况

接下来，研究人员利用流式细胞术和荧光成像定量分析DCs的水平。结果显示，在下午接种肿瘤，小鼠体内产生的CD11c+MHCII+细胞群，即以DCs为主的白细胞亚群，其数量要远高于凌晨接种的。

为了进一步探究淋巴结（dLN）中相关的肿瘤源性抗原提呈细胞（APCs）的节律性，研究人员利用SIINFEKL肽特异性抗体结合小鼠MHC-I类分子（H-2Kb）。结果发现，CD103+CD11c+MHCIIhi（SIINFEKL:H-2Kb）+ 表型的APCs数量同样是在下午时更多。

这些结果表明，DCs应对抗原的反应也是具有昼夜节律性的，在下午接种肿瘤细胞产生DCs的数量多于凌晨。

接种肿瘤后，不同时间段DCs的水平

随后，利用基因敲除的手段，研究人员构建了T细胞缺失关键节律性基因Bmal1的小鼠（Bmal1ΔTcell），以及DCs缺失Bmal1的小鼠（Bmal1ΔcDC）进行实验。

结果发现，Bmal1ΔTcell和Bmal1ΔcDC小鼠的肿瘤体积在下午和凌晨接种肿瘤的组间均未展现出差异。同时，Bmal1ΔcDC小鼠dLN中DCs数量也未表现出差异性。值得一提的是，Bmal1ΔcDC小鼠体内的抗原特异性CD8+T细胞的水平有所降低，并且节律性消失。这些结果说明，关键节律性基因和细胞自主节律振动在T细胞和DCs节律性控制肿瘤生长过程中发挥着重要作用，并初步证实DCs主导着节律性CD8+T细胞的反应。

CD8+T细胞和DCs缺失关键节律性基因的小鼠肿瘤体积变化和淋巴结中DCs、CD8+T细胞数量变化

研究人员还运用RNA序列（RNAseq）测序对DCs亚群进行了分析，发现两个主要的震动基因簇，一个在下午具有高表达，另一个在晚上具有高表达。下午高表达的基因簇主要由共刺激分子代谢基因组成，晚上高表达的基因簇与T细胞激活途径息息相关。这些数据表明，DCs共刺激因子可能是节律性CD8+T细胞激活表型产生的原因。

DCs表现出昼夜节律性基因表达模式

除此之外，流式细胞术证实，在不同CD11c+树突状细胞亚群中，共刺激分子CD80的表达水平受细胞自主节律控制。同时，CD80与CD8+T细胞的节律反应性以及小鼠肿瘤体积大小均具有相关性。该结果进一步表明，肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的昼夜节律反应依赖于共刺激分子CD80的昼夜节律表达。

CD80在不同时间的表达，CD8+T与BMDCs共培养情况与CD80对肿瘤生长的影响

最后，为了评估此项发现的转化潜力，研究人员在下午时为小鼠接种B16-F10-OVA黑色素瘤，之后在下午或凌晨时用OVA模拟抗原进行免疫。

结果发现，与凌晨相比，下午接种疫苗小鼠的肿瘤受到了显著的抑制。相反，缺失关键节律性基因的Bmal1ΔcDC小鼠在不同时间接种疫苗后肿瘤体积没有显著性差异。同时，DCs呈现出CD80的昼夜节律性表达，并控制着CD8+T的增殖。这些结果说明DCs的节律性在抗肿瘤免疫反应中起着关键作用。

此外，在黑色素瘤病人体内，研究人员发现，在早上接种疫苗（黑色素瘤-A肽, CpG 7909和弗氏不完全佐剂）较下午可以产生更多的抗原特异性CD8+T细胞，这与人体的昼夜节律特征相符，表明节律性的抗肿瘤免疫反应同样存在在人体细胞中。

给予疫苗后小鼠肿瘤体积变化和CD80的表达情况；人类细胞中CD8+T细胞与DCs共培养和给予疫苗后的增殖情况

总的来说，研究人员发现DCs和CD8+T细胞均具有昼夜节律性的抗肿瘤功能，并且DCs依赖于共刺激分子CD80的昼夜节律表达，支配着CD8+T细胞的节律性行为。免疫治疗时间点与免疫激活效率最大的时间点同步时，在小鼠和人体内均具有最佳的肿瘤治疗效果。

后续，研究人员将通过临床研究进一步验证和探索免疫细胞的昼夜节律性，并运用这些发现，研发出针对肿瘤的更有效的治疗方案。

参考文献：

[1] Chen DS, Mellman I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 2017;541(7637):321-330. doi:10.1038/nature21349

[2] Curtis AM, Bellet MM, Sassone-Corsi P, O'Neill LA. Circadian clock proteins and immunity. Immunity. 2014;40(2):178-186. doi:10.1016/j.immuni.2014.02.002

[3] Pick R, He W, Chen CS, Scheiermann C. Time-of-Day-Dependent Trafficking and Function of Leukocyte Subsets. Trends Immunol. 2019;40(6):524-537. doi:10.1016/j.it.2019.03.010

[4] Palomino-Segura M, Hidalgo A. Circadian immune circuits. J Exp Med. 2021;218(2):e20200798. doi:10.1084/jem.20200798

[5] Druzd D, Matveeva O, Ince L, et al. Lymphocyte Circadian Clocks Control Lymph Node Trafficking and Adaptive Immune Responses. Immunity. 2017;46(1):120-132. doi:10.1016/j.immuni.2016.12.011

[6] de Bree LCJ, Mourits VP, Koeken VA, et al. Circadian rhythm influences induction of trained immunity by BCG vaccination. J Clin Invest. 2020;130(10):5603-5617. doi:10.1172/JCI133934

[7] Papagiannakopoulos T, Bauer MR, Davidson SM, et al. Circadian Rhythm Disruption Promotes Lung Tumorigenesis. Cell Metab. 2016;24(2):324-331. doi:10.1016/j.cmet.2016.07.001

[8] Wang C, Barnoud C, Cenerenti M, et al. Dendritic cells direct circadian anti-tumor immune responses [published online ahead of print, 2022 Dec 5]. Nature. 2022;10.1038/s41586-022-05605-0. doi:10.1038/s41586-022-05605-0