Nucleic Acids Res | 破解60年难题！周小龙团队实现RNA定点高效乙酰化修饰

RNA上修饰了超过150种不同的化学修饰，统称为RNA RNA表观遗传学。在各种RNA类别中，转运RNA ( transfer RNAs，tRNAs )具有最广泛和多样的修饰，占鉴定到的修饰的80% 。

乙酰化是一种普遍存在的转录后修饰，存在于各种类型的RNA [信使RNA ( mRNA )、tRNA和核糖体RNA ( rRNA )]中，遍及生命的所有分支。迄今为止，已经报道了两个乙酰化残基，N6 -乙酰腺苷( ac⁶A )和N4 -乙酰胞苷( ac⁴C )。而ac⁶A只存在于古菌的tRNAs 中，ac⁴C则存在于生命体的所有结构域中。ac4C在人类mRNA编码区的优势分布是先前观察到的。之前已经观察到ac⁴C在人类mRNA编码区的优势分布。然而，最近的一项研究未能在生理条件下鉴定人和酵母mRNA中的ac⁴C位点。在哺乳动物和酵母的18S rRNA中也发现了ac⁴C的修饰，它有助于rRNA前体的加工和翻译的准确性。

在细菌tRNA中，ac⁴C只存在于延伸体甲硫氨酸tRNA的摆动位置(第34位, ac⁴C³⁴)。在此位置，乙酰化主要由GCN5相关的乙酰转移酶TmcA催化。因此，ac⁴C³⁴修饰可以通过TmcA在体外成功重组。对TmcA的生化和结构研究揭示了其催化机理，表明其利用乙酰辅酶A (作为乙酰基供体)和ATP作为底物。此外，最近的一项研究鉴定了枯草芽孢杆菌中负责ac⁴C³⁴生物合成的甲硫氨酸tRNA胞苷乙酸酯连接酶( TmcAL )。对TmcAL活性的重构发现，TmcAL以乙酸盐为乙酰基供体，其催化机制( tRNA类氨酰化机制)和结构域组成与TmcA完全不同，ac⁴C³⁴通过确保AUG Met密码子的精确解码，同时防止近同源AUA Ile密码子的误读，对翻译的准确性起着至关重要的作用。

古菌tRNA也存在ac⁴C修饰，但修饰位点更为多样，覆盖了多种古菌的多个tRNA。古菌ac⁴C修饰酶已被鉴定。古菌tRNA ac⁴C修饰在较高温度下受到刺激，乙酰转移酶缺陷型菌株表现出温度依赖性生长缺陷，表明温度依赖性ac⁴C生物合成是古菌独特的适应性生存策略。然而，ac⁴C修饰的缺失对古菌tRNA的熔解温度( Tm )没有影响。迄今为止，有关古菌ac⁴C修饰酶活性的体外研究尚未见报道。

ac⁴C水平的改变与多种人类疾病相关，包括炎症、糖尿病、肾衰竭、肺纤维化、多发性硬化症和各种感染。由于ac⁴C在mRNA、tRNA和rRNA上的广泛分布，ac⁴C相关疾病不能仅仅归因于tRNA的低修饰。然而，THUMPD1中的一系列双等位基因变异会损害其活性，并导致ac⁴C¹²修饰的丢失。这些变化导致了一种综合征形式的智力残疾，突出了tRNA ac⁴C¹²与人类疾病的直接关联。

尽管该领域对细菌ac⁴C³⁴生物合成的分子机制及其在Met密码子解码中的生物学意义有了较为清晰的认识，但目前对真核生物ac⁴C¹²修饰的认识，包括修饰机制、tRNA底物选择、结构基础及其对tRNA结构和功能的影响等，仍然非常有限。此外，Tan1 / THUMPD1在ac⁴C¹²生物发生中的结构和功能知之甚少。此外，NAT10和THUMPD1致病变异的机制尚不清楚。这些局限性至少部分源于真核生物tRNA ac⁴C¹²修饰从未在体外重组。因此，最近一项研究ac⁴C¹²对tRNA热力学性质的潜在影响依赖于tRNA D - arm中含ac⁴C¹²片段的化学固相RNA合成，但不能利用完整的tRNA。由于未能制备出ac⁴C¹²修饰的tRNA，极大地阻碍了对ac⁴C¹²在tRNA结构和功能中的分子机制和潜在作用的理解。

模式图（Credit: Nucleic Acids Research)

因此，该研究基于已解析和预测的酵母Kre33结构，构建并纯化了一个C -末端柔性结构域( flexible domain，FD )截短的Kre33。通过Kre33-Tan1活性成功重组了tRNASer和tRNALeu的ac⁴C¹²修饰。体外和体内数据表明，Tan1识别tRNA是通过协调的蛋白质- RNA相互作用介导的。现ac⁴C¹²至少在体外对tRNA转录本的Tm值没有影响，在体内和体外对tRNASer和tRNALeu的带电水平也没有影响。总之，该结果首次在体外重建了ac⁴C¹²的修饰，并提出了真核生物ac⁴C¹²生物合成中tRNA底物选择的原则，为进一步研究真核生物ac⁴C¹²修饰的分子机制、结构基础和功能意义以及ac⁴C¹²相关疾病的分子病因学奠定了坚实的基础。