酵母表达纳米抗体方面取得新进展

近日，免疫所禽用疫苗抗原创制创新团队在酵母表达纳米抗体方面取得重要进展，研究成果以题为“AUniversal Strategy for the Efficient Expression of Nanobodies inPichia pastoris”发表于《Fermentation》杂志。

在骆驼科和鲨鱼科动物的血清中天然存在轻链缺失的抗体，其重链的可变区是已知有效结合完整抗原片段的最小单元，因此被称为纳米抗体。近年来，纳米抗体在疾病治疗、成像诊断、病毒中和以及ELISA检测等方面发挥着关键性作用。毕赤酵母无内毒素风险，具有较强的分泌表达能力，能够以低廉的成本进行高密度发酵，因此是表达纳米抗体的理想宿主。毕赤酵母生产的多种纳米抗体药物如ALX-0061、ALX-0171、Everestmab等已进入临床阶段。本研究利用Va、Vb和Vc三种纳米抗体作为模式蛋白，探索通用型纳米抗体高效表达技术。

首先，通过改变lox71的位置构建出能够实现双抗性基因敲除的亲本质粒pLD。启动子和信号肽的优化使Va产量分别增加1.38倍和1.89倍。优化基因剂量可使Va产量提高1.39倍。在野生型AOX1启动子的控制下25种分子伴侣蛋白与Va共表达，其中HAC1使Va产量提高1.5倍。在此基础上使用弱化的AOX1启动子突变体55p对HAC1的表达强度进行微调，Va产量进一步增加2.41倍。最后通过高密度发酵Va产量达到2.13g/L，与初始菌株1-AOXα-Va的摇瓶表达产量相比提高49.8倍。将pLD-55p-HAC1质粒整合到GS115基因组中形成预整合HAC1分子伴侣的H55宿主，将多拷贝质粒转化到该宿主后Vb和Vc产量分别增加1.98倍和2.34倍。无抗生素亲本质粒的工程设计、表达元件的修饰、基因剂量的优化以及H55宿主被组合成一种复合策略，为未来纳米抗体的高效酵母表达铺平道路。

无抗化毕赤酵母表达平台是禽用疫苗抗原创制创新团队的核心表达平台之一，基于该平台多种酶制剂的产量已达到10g/L以上水平。重组人胶原蛋白、塑料降解酶、KEX2、肠激酶、犬α干扰素、猫犬白蛋白及CSFVE2抗原、PCV3Cap抗原等重组蛋白亦借助该平台实现高效表达。

硕士研究生郑毅恒为论文第一作者，免疫所禽用疫苗抗原创制创新团队李丁副研究员为论文通讯作者。该研究得到国家自然科学基金（32002316、31961133017）的资助。

图1甲醇诱导基因重组示意图