Science：改写教科书！小脑中复杂的浦肯野细胞连接比想象中更普遍

1906 年，西班牙科学家Santiago Ramón y Cajal因他对大脑微观结构的开创性研究而获得诺贝尔奖。他绘制的小脑浦肯野细胞（Purkinje cell）图非常有名，图中显示了神经元结构：从胞体中冒出多个大分支，并分裂成美丽的叶状图案。

虽然这些早期的描绘捕捉到了从胞体延伸出来的多个树突，但时至今日，神经科学家们普遍认为，浦肯野细胞只有一个初级树突（primary dendrite），这个初级树突与来自脑干的单根攀缘纤维（climbing fiber）相连。在一项新的研究中，来自美国芝加哥大学的研究人员发现Cajal的绘图一直都是准确的---人类小脑中几乎所有的浦肯野细胞都有多个初级树突。相关研究结果发表在2023年7月28日的Science期刊上，论文标题为“Climbing fiber multi-innervation of mouse Purkinje dendrites with arborization common to human”。

在小鼠身上进行的进一步研究表明，大约 50% 的小鼠浦肯野细胞也具有这种更复杂的结构，其中 25% 的细胞接受来自多个攀缘纤维的输入，这些攀缘纤维与不同的初级树突分支相连。在活体小鼠体内记录细胞活动的实验还显示这些初级树突分支可以被独立激活，对来自环境的不同刺激做出反应。

论文通讯作者、芝加哥大学神经生物学教授Christian Hansel博士说，“你在头脑中对细胞的某个原型研究得越多，你就越能接受它。”他指的典型模型是：浦肯野细胞有一个初级树突，这个初级树突与一条攀缘纤维相连。“Cajal的这些绘图从20世纪就已经出现了，所以我们绝对有足够的时间去关注，但直到现在通过这种定量分析，我们才发现人类细胞每个都有多个完整树突几乎是普遍现象，而且我们可以看到这也会带来质的不同。”

改写教科书上的观点

小脑位于颅底，就在脊髓连接处的上方。自 1824 年法国医生Jean Pierre Flourens首次描述小脑的功能以来，科学家们一直认为小脑的唯一工作就是协调运动和肌肉活动，但科技的进步表明，小脑在处理身体内外环境的输入（包括本体感觉和平衡感）方面也发挥着重要作用。

小脑浦肯野细胞就像一个巨大的天线，接收来自身体其他部位的成千上万个输入信号，这些信号传递着一系列环境信息。然后，这些信号与预测误差信号（prediction-error signal）整合在一起，表明环境信息与大脑的预期不匹配。这种预测误差信号由神经纤维提供，这些神经纤维从脑干向上攀爬，并与目标浦肯野细胞的树突结构相连接。这些神经被称为“攀缘纤维”是非常恰当的。

图片来自Science, 2023, doi:10.1126/science.adi1024。

对这些连接的标准理解是，每个浦肯野细胞都有一个初级树突，从胞体分支出来并与一条攀缘纤维连接，形成一个计算单元。攀缘纤维和浦肯野细胞之间这种一一对应关系的信念是该领域的核心教条，在每本神经科学教科书中都能找到，这种信念主要来自对啮齿动物的研究，而啮齿动物主要具有单树突结构。

不过，过去对这些结构的许多研究都集中在少量细胞上，因此在这项新的研究中，论文第一作者、Hansel实验室的博士生Silas Busch首先观察了来自人类和小鼠组织的数千个细胞。他使用一种基于抗体的定向染色技术，即免疫组化技术，选择性地标记小脑薄片中的浦肯野细胞。

然后，他对能观察到的所有浦肯野细胞的结构进行了分类，发现超过95%的人类浦肯野细胞有多个初级树突，而小鼠的这一数字更接近一半。

Busch说，“从解剖学角度看，它们被称为细胞的‘初级’树突，因此你可以感觉到这是该领域的一个流行观点。因此，即使是对这些细胞结构的描述，也是基于小鼠的原型，它有一个树突，你可以称其为初级树突。”

在哺乳动物甚至其他脊椎动物共有的进化过程中最保守的大脑区域之一，存在着这种显著的物种差异，这让Busch和Hansel开始思考，拥有多个而非仅有一个初级树突是否会产生功能性后果。他们首先怀疑的是攀缘纤维，这种纤维与初级树突有着一对一的关系和紧密的缠结。

Busch利用含有活细胞的小鼠小脑切片，给这些细胞注射染料以观察它们的树突分支，然后刺激攀缘纤维输入。他观察到25%具有多个初级树突的浦肯野细胞接收到多条攀缘纤维，这改写了教科书上的观点，即每个浦肯野细胞只能获得一条攀缘纤维输入，而具有单个初级树突的细胞则不能。

行走的小鼠和摆动的胡须

有相当一部分---尽管是少数---具有多个初级树突的浦肯野细胞也能从多条攀缘纤维获得输入，这一发现令Busch大受鼓舞，他在活体小鼠身上进行了一系列实验，以观察这是否会导致活体小鼠的功能差异。

首先，他将一种荧光钙指示剂染料注入小鼠小脑，并植入一个小玻璃窗，以便日后观察钙流入浦肯野细胞树突的情况。当小鼠在跑步机上跑步时，他将小鼠的头部固定在显微镜下，这样就能测量表明攀缘纤维何时向细胞提供了强大输入的钙流动。

在具有一个初级树突的浦肯野细胞中，高分辨率图像显示整个细胞结构中的活动信号是均匀的；而在具有多个初级树突的浦肯野细胞中，他可以检测到每一侧在不同时间发生的活动，这意味着一个树突可能被它的攀缘纤维激活，而同一细胞中的另一个树突却没有被激活。

接下来，Busch想看看他是否能通过使用更精确的刺激物---小鼠的胡须---来找出单个攀缘纤维的活动。不过在这项实验中，Busch必须给小鼠注射镇静剂。

在小鼠睡着后，Busch将单根胡须穿入一个小玻璃管中，并来回摆动。在这时，他还能看到浦肯野细胞不同树突分支的活动，这表明单个攀缘纤维正在将来自单个胡须的输入信号传递给单个树突。

最后，为了获得更真实的场景，Busch还用几种刺激物对清醒的小鼠进行了测试，如闪光、声音或胡须垫上的气泡。同样，他发现不同的浦肯野细胞之间存在差异。在一些小鼠中，一个树突分支会不同程度地偏爱一种刺激，因此它可能对光特别敏感，但对声音却不敏感。而另一个树突分支则可能对声音有偏好反应，但对光没有反应。

Busch说，“这种情况只发生在少数浦肯野细胞中，因为小鼠中具有多个树突分支的浦肯野细胞较少，而且并非所有浦肯野细胞都有多个攀缘纤维，但这种效应的存在仍然非常有趣。它证实了这一观点，即两条攀缘纤维输入会有不同的功能目的，代表不同的信息。”

小脑的连接性变得更加清晰

这一新证据颠覆了人们对一个在解剖学上被认为是相当复杂的大脑区域的标准看法，同时也产生了功能性后果。当攀缘纤维提供来自脑干的输入时，浦肯野细胞会聚合并处理这些信息。在这些细胞上多点连接的多个输入可提供更强的计算能力，使大脑回路能够适应和响应环境或身体需要不同运动的变化，而这种非典型连接与浦肯野细胞树突的结构密切相关。

也有证据表明，小脑中的这些连接可能与疾病有关。例如，2013年，Hansel与芝加哥大学神经学家Christopher Gomez博士）合作进行了一项研究，结果表明，在小脑共济失调（一种运动障碍）的小鼠模型中，浦肯野细胞-攀缘纤维连接较弱。

另一方面，Busch、Hansel和Gomez与芝加哥大学前研究生Dana Simmons共同发表的研究成果显示，在自闭症的基因复制和过表达模型中，这些连接更强。其他研究人员的研究也表明，某些类型的震颤也存在更强的联系。希望对这些细胞的基本生物结构有更多的了解，能让我们对这些疾病有更深入的认识。

Hansel说，“研究大脑其他部分（如新皮层或海马体）的人总是或多或少地知道大脑结构在做什么。我们这些研究小脑的人总是有这样的想法，即小脑是运动协调和适应的，但也很清楚，小脑的作用远不止于此。如今，随着小脑连接性变得越来越清晰，我们将更容易掌握它。”（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Silas E. Busch et al. Climbing fiber multi-innervation of mouse Purkinje dendrites with arborization common to human. Science, 2023, doi:10.1126/science.adi1024.