Cell：拷贝数 ≠ 表达量？wellDR-seq全景式解析ER+乳腺癌的祖先谱系与基因调控新法则

工程师的巧思：如何构建“DNA与RNA的双重阅读器”

同时捕获基因组DNA和转录组mRNA，为什么如此困难？这首先是一个物理化学上的挑战。

在单个细胞内，DNA被紧密地包裹在细胞核的染色质（chromatin）结构中，受到组蛋白的严密保护；而我们关心的信使RNA (mRNA) 则主要分布在细胞质中，结构脆弱且易于降解。传统的基因组测序（scDNA-seq）需要严苛的细胞裂解条件来释放并纯化DNA，这个过程足以将RNA彻底摧毁。反之，转录组测序（scRNA-seq）采用温和的裂解方式以保护RNA，但这又远远不足以打开染色质的枷锁，导致绝大多数基因组DNA无法被捕获。

现有的多组学技术往往顾此失彼。例如，一些方法依赖物理分离细胞核和细胞质，操作繁琐且通量极低，仅限于几十个细胞；另一些方法试图在核内同时捕获DNA和RNA（如DEFND-seq），但它们不可避免地丢失了细胞质中占绝大多数的成熟mRNA，导致RNA数据质量严重受损。

我们需要一种巧妙的化学方法，在同一个微小的反应孔中，让DNA和RNA“和平共处”并被分别标记。wellDR-seq（基于纳米孔的单细胞DNA和RNA测序）正是为此而生。

研究人员使用了一个包含5184个纳米反应孔（nanowell）的芯片。当单个细胞被分配到这些微孔中后，真正的“魔法”开始了。

第一步：彻底解放。 研究人员没有使用常规的裂解液，而是加入了一种关键的蛋白酶（protease）。这种酶如同一种万能溶剂，它会消化掉细胞膜、核膜以及所有束缚DNA的组蛋白。其结果是，细胞内的一切蛋白质结构都被清除了，只剩下纯粹的核酸，基因组DNA和细胞内的所有RNA，完全裸露地释放到纳米孔的微小反应体系中。这是实现双重捕获的化学基础。

第二步：分轨标记。 既然DNA和RNA都已可用，研究人员使用了一种“分而治之”的策略同时给它们打上标签。对于DNA，使用Tn5转座酶（Tagmentation）将其切割成片段并连接接头。对于RNA，使用经典的Poly-dT引物特异性抓取mRNA，并通过逆转录（RT）将其转化为cDNA。

第三步：巧妙的“生物素开关”。 在逆转录过程中，研究人员加入了一个巧妙设计的模板转换寡核苷酸（Template Switch Oligonucleotide, TSO）。这个TSO除了完成cDNA的合成外，还携带了一个关键的“货物”——生物素（biotin）标签。这意味着，细胞中所有由mRNA逆转录而来的cDNA分子，都被悄悄地打上了一个生物素标记。而基因组DNA碎片则没有这个标记。

第四步：统一的细胞条码。 接下来，通过几轮精心设计的PCR反应，研究人员为来自同一个纳米孔的所有cDNA和DNA碎片，都连接上独一无二的细胞条码（cell barcodes）。例如，来自A1孔的细胞，其cDNA和gDNA都会被标记上“A1”这个地址。

第五步：捕捞与分离。 当所有反应完成后，研究人员将5184个孔中的所有产物混合在一起，形成了一个包含数千个细胞的DNA和cDNA的“大汤锅”。此时，生物素标签派上了用场。研究人员加入了链霉亲和素磁珠（Streptavidin beads），如同钓鱼一般，所有携带生物素的分子（即全部的cDNA）都被磁珠“钓”了上来。而那些没有被钓上来的、漂浮在“汤”里的，自然就是所有的基因组DNA。

通过这一系列巧妙的步骤，wellDR-seq成功地从同一个细胞群体中获得了两个独立的文库：一个代表功能（转录组），一个代表蓝图（基因组），而它们可以通过细胞条码被完美地一一对应。

严苛的基准测试：新的阅读器超越了“专科医生”吗？

一项多组学技术最大的风险在于“贪多嚼不烂”，试图同时做两件事，结果可能两件都做不好。wellDR-seq是否在捕获RNA的同时牺牲了DNA的质量？或者反之？研究人员使用乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行了一场严苛的“性能摸底测试”。

评估DNA：高覆盖率与低噪音

研究人员将wellDR-seq与四种专攻DNA的单细胞测序技术（包括Arc-well, 10X CNV, DLP+, DOP-PCR）以及另一种多组学技术（DEFND-seq）进行了正面比较。评估scDNA-seq质量有两个核心指标：过离散度（Overdispersion），代表技术噪音，越低越好；以及覆盖广度（Breadth of coverage），代表能看到多少基因组区域，越高越好。

数据显示，wellDR-seq在噪音控制上与表现最好的Arc-well技术相当，同时显著优于其他所有方法。更重要的是，在覆盖广度上，wellDR-seq完胜了10x CNV, DLP+, DOP-PCR, 和 DEFND-seq。这证明wellDR-seq的DNA数据质量是顶级的。光有质量还不够，它读得“准”吗？研究人员进一步将其与单细胞数据的“金标准”——来自同种细胞系的克隆群体全基因组测序（bulk WGS）——进行对比。结果令人振奋：wellDR-seq生成的假体细胞（pseudobulk）CNA图谱与WGS数据的相关性达到了惊人的 r = 0.965；而在更精细的单个亚克隆水平上，平均相关性也达到了 r = 0.966。

这表明，wellDR-seq在读取DNA蓝图方面，表现如同一位经验丰富的专科医生。

评估RNA：读到我们真正想要的（外显子）

那么RNA呢？研究人员将wellDR-seq与三种主流scRNA-seq方案在相同的测序深度下（约每细胞26,000条读数）进行了比较。wellDR-seq的表现非常出色，平均检测到约2,650个基因，与专攻转录组的Takara平台旗鼓相当。然而，关键在于读到的序列“是什么”。研究人员分析了这些RNA读数在基因组上的分布。结果显示，wellDR-seq有高达92.0%的读数精确地映射到了外显子（Exons）区域，这正是真正编码蛋白质的功能序列。相比之下，10x Genomics的外显子映射率仅为76.4%，而DEFND-seq更只有9.1%。

结论是明确的：wellDR-seq不仅能检测到高数量的基因，而且它检测到的是高质量的、具有真正生物学意义的成熟转录本。

最后的论证：为什么我们不能“猜”？

此时，一个关键问题浮出水面：我们能否利用计算工具，直接从RNA的表达量“推断”出DNA的拷贝数（CNA）呢？为了回答这个问题，研究人员使用了两种最先进的推断工具（CopyKAT和inferCNV），并将它们应用于wellDR-seq产生的高质量RNA数据上，试图“重建”这些细胞的CNA图谱。然后，他们将“推断”出的CNA图谱与他们手中“实测”到的DNA图谱（来自同一个细胞）进行比较。

结果是毁灭性的。计算推断出的CNA图谱与真实的DNA图谱几乎完全不同，相关性分别仅有 r = 0.52 和 r = 0.49。 这些计算工具不仅完全漏掉了肿瘤中关键的亚克隆结构，还“凭空捏造”了大量根本不存在的CNA事件。

这项对比提供了强有力的证据：推断不能替代检测。 在复杂的癌症生物学中，试图用一份手稿（RNA）去猜测另一份手稿（DNA）的内容，是一种极其不可靠的策略。我们必须，也只能，在同一个细胞中同时阅读这两份手稿。

癌症侦探：揪出乳腺癌的“第一颗种子”

有了这把利器，研究人员立即投身于临床实践，他们分析了来自12名ER+（雌激素受体阳性）乳腺癌患者的样本。他们的第一个目标，就是利用wellDR-seq的双重数据，去追捕那个难以捉摸的癌症“起源细胞”。

P1号患者的离奇案件与“c2”亚克隆

在P1号患者的2,901个单细胞中，一场精彩的侦探故事上演了。通过对DNA蓝图进行聚类，研究人员发现了22个截然不同的基因亚群。其中，c1集群是完全正常的二倍体细胞。而c3到c22集群，则是基因组的“重灾区”，是构成肿瘤主体的“邪恶军团”。

然而，c2集群成了一个异类。它只占细胞总量的一小部分，其基因组上唯一的、清晰的异常是丢失了整条22号染色体（chr22 loss）。

当研究人员构建这些亚克隆的进化树（Phylogenetic tree）时，整个故事线清晰了：正常的c1细胞发生了突变，变成了c2细胞。在某个时间点，c2细胞又经历了一次全基因组加倍（WGD）事件，并以此为起点，最终“进化”并分化出了c3到c22这20个不同的癌症亚克隆。这意味着，c2就是这个肿瘤的“祖先亚克隆”（ancestral subclone），是那颗埋藏在正常组织中的“第一颗种子”。

连接蓝图与身份：“祖先”究竟是谁？

这个祖先细胞，在它癌变之前，究竟是一种什么类型的正常细胞？这是只有wellDR-seq才能回答的问题。研究人员立刻调取了这些DNA集群对应的RNA数据。正常的c1细胞是混合体，晚期的癌症军团（c3-c22）则完全一致地聚集在一个独特的“癌症”RNA集群中。

令人惊讶的是，那颗神秘的种子（c2亚克隆）的RNA身份并不在“癌症”集群里。它隐藏在正常细胞中。数据显示，c2细胞的转录组特征，与正常的管腔激素反应细胞（Luminal Hormone-Responsive, LumHR）完全吻合。在另外三名患者中，研究人员也发现了同样的模式，他们找到的祖先亚克隆，无一例外，全部指向LumHR细胞。

这一系列证据共同构筑了一个清晰的癌症起源模型：至少对于这部分ER+乳腺癌而言，癌症的“第一颗种子”来自一种已经分化的、响应激素的LumHR细胞。这个正常的LumHR细胞首先遭受了第一次基因打击（如chr22 loss），变成了“祖先亚克隆”。这个“受伤”的细胞群体可能潜伏了很长时间，直到某个契机触发了第二次打击，导致其基因组彻底失稳，最终演化为侵袭性癌症。为了给这个结论钉上最后一颗钉子，研究人员甚至在祖先c2细胞中找到了12个在正常细胞中不存在，却在所有癌细胞中100%存在的点突变。证据链形成了完美的闭环。

改写剂量法则：当10份拷贝不等于10倍产出

如果说找到癌症的“种子”是wellDR-seq的第一个重大贡献，那么它接下来的发现，则从根本上挑战了我们对癌症进化驱动力的理解，即经典的“基因剂量效应”（gene-dosage effect）。

这个经典法则非常直观：基因的拷贝数决定了基因的表达水平。更多的DNA拷贝 = 更多的RNA产出。而现在，wellDR-seq可以在同一个细胞里，同时手握“拷贝数”（因）和“表达量”（果）。

宏观尺度（染色体片段）：法则成立

首先，研究人员在宏观尺度上检验了这一法则。他们分析了所有发生CNA的染色体大片段。结果呈现出一条近乎完美的线性相关曲线（R = 0.93）。随着DNA拷贝数从1份攀升到惊人的13份，对应片段上的RNA平均表达量也随之线性飙升。在整个研究队列中，高达56%的CNA片段都显示出与其基因表达水平相一致的变化。这证实了我们的传统认知：在宏观平均水平上，基因剂量法则是成立的。

微观尺度（单个基因）：法则崩溃

然而，当研究人员将镜头推向单个基因时，这个简单的图景瞬间崩溃了。他们发现，基因对拷贝数变化的反应并非铁板一块，而是呈现出截然不同的两种命运：

1. 剂量敏感型（Dosage-sensitive）基因： 这些基因是“守法公民”，其RNA表达水平与DNA拷贝数严格相关。许多关键的乳腺癌相关基因都属于此类，例如PGR、AURKA和RB1。

2. 剂量不敏感型（Dosage-insensitive）基因： 这些基因则是“规则豁免者”。无论它们所在的DNA片段如何疯狂扩增或丢失，它们自身的RNA表达水平都“岿然不动”。令人震惊的是，这份“豁免名单”上赫然列着几个乳腺癌中“鼎鼎大名”的驱动基因：PIK3CA、BRCA1和TP53。

这是一个极其深刻的发现。它告诉我们，肿瘤的进化远比我们想象的要复杂。对于像PIK3CA这样的超级致癌基因，它的失调依赖于其他更精巧的机制（例如点突变）。这些关键基因，已经进化到可以“无视”基因组剂量效应。

涟漪效应：31%的“本地（Cis）”行动 vs 69%的“跨区（Trans）”混沌

如果说“剂量不敏感”基因揭示了法则的例外，那么wellDR-seq的下一个发现则揭示了CNA驱动癌症的真正威力——跨区域的涟漪效应。传统观点认为“本地效应”应该是主导。但wellDR-seq的数据彻底颠覆了这一点。

研究人员在所有患者的亚克隆进化对中进行了统计，结果令人瞠目：在所有导致功能差异的差异表达基因（DE genes）中，平均只有31%的基因是“本地（in-cis）”的——即它们确实位于那些新发生拷贝数变化的区域。这意味着，平均有高达69%的功能变化，发生于“跨区（in-trans）”！

换言之，当肿瘤获得一个新的CNA时，其最主要的后果，不是让本地基因的产出增加，而是像一块石头砸入平静的湖面，激起的“涟漪”扩散到了整个基因组，导致了其他所有“基因组稳定”的染色体上发生了大规模的功能（表达）海啸。

被解码的双重手稿

这项研究，为我们提供了一块破解癌症复杂性的“罗塞塔石碑”。wellDR-seq这项技术用数据证明（例如r=0.49的推断失败案例），我们不能再满足于猜测一份手稿的内容；我们必须同时、同地、同细胞地阅读这两份手稿。

通过这块石碑，该研究重写了乳腺癌生物学的两个关键篇章：

第一，癌症的起源故事。研究首次将“祖先基因型”（如c2亚克隆的chr22 loss）与其“细胞身份”（LumHR表型）直接锁定在同一个细胞中，为ER+乳腺癌的“管腔细胞起源说”提供了迄今为止最直接的证据。癌症的种子并非凭空产生，而是潜伏在那些看似正常的、响应激素的细胞中。

第二，癌症的进化法则。研究彻底解构了简单粗暴的“基因剂量效应”。癌症进化不是简单的DNA加减法，而是一个交织着“剂量敏感”与“剂量不敏感”基因的复杂系统。肿瘤每一次基因组的变动（CNA），其最主要的驱动力甚至不是本地基因的改变（仅占31%），而是它所激发的覆盖全基因组的“跨区（trans）”功能涟漪（占69%）。

这为我们开辟了全新的视野：未来我们评估一个基因是否为驱动基因，或许不再仅仅看它是否被扩增或删除，而是要看它是否“剂量敏感”；我们理解癌症的进化，也必须从线性的“CNA累积”转向非线性的“跨区网络调控”。这正是解读癌症双重手稿的真正意义所在。