《科学》：分析了40万个T细胞，发现它们“躺平”的方式竟千差万别

近年来，癌症免疫疗法（主要是靶向T细胞）在临床上取得了巨大的成功，极大地延长了癌症患者的生存期，但是不同类型癌症的治疗效果却天差地别。

这主要是因为免疫疗法的效果不仅取决于癌症患者的肿瘤免疫浸润状况，还与肿瘤免疫微环境中效应T细胞是否更容易变成“耗竭”状态有关，两者在不同类型癌症中均有着较大差异。

一直以来，肿瘤免疫治疗领域还没有关于不同癌症免疫微环境的系统性比较的研究，随着单细胞技术以及的TCR测序技术的兴起，这层神秘面纱正在被逐渐揭开[1]。

近日，由北京大学的张泽民、季加孚、步召德以及胡学达四位科学家领衔的研究团队在《科学》发表重要研究成果[2]。

他们利用单细胞技术建立了一个涉及21种癌症类型、包含397810个T细胞的转录组图谱。他们发现T细胞转变成耗竭状态有着多种不同的方式，不同类型癌症会有特异的方式，并且特定的T细胞亚群与患者的一些属性有关，例如突变负荷，这表明肿瘤微环境在这其中可能有重要作用。

肿瘤的免疫浸润淋巴细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，被称为免疫微环境，而其中影响患者对免疫治疗应答情况的是T细胞，一旦大量的T细胞从有功能的效应T细胞状态进入到失能的耗竭状态，免疫治疗的效果便会大打折扣。

不同癌症的T细胞耗竭过程是不一致的，有研究发现在黑色素瘤患者中，CD8+T细胞会逐渐线性地从失能前状态变成耗竭T细胞[3]；而肺癌患者中T细胞则有两种失能前状态[4]。这个动态的过程还受到多种转录因子的调控。

不仅如此，不同类型癌症的T细胞特征也不尽相同，例如和肺癌相比，肝癌以及结肠癌的耗竭T细胞比例要更高[5]，而多发性骨髓瘤则几乎没有耗竭T细胞[6]。

但目前这方面的研究都只局限于比较3到4种癌症，并不够全面。鉴于此，张泽民教授等人建立了一个包含21种癌症的T细胞的单细胞转录组图谱，一共有来自316例患者的397810个T细胞，这些细胞分别取自肿瘤组织、癌旁组织以及外周血。他们测了其中46.4%的细胞，其余的来自于经过批次校正的已发表数据。

他们从这些T细胞中一共鉴别出了17种CD8+元亚群和24种CD4+元亚群，这些亚群被80%的癌症类型所共有。

这其中有以前被报道的也有新发现的，包括GZMK+效应记忆T细胞（Tem）、终末分化效应记忆T细胞（Temra）、ISG+T细胞、KIR+NK样T细胞、组织驻留记忆T细胞（Trm），以及四种耗竭CD8+T细胞（Tex）、三种滤泡辅助T细胞（TFH）和四种调节T细胞（Treg）。

通过组织间的比较，他们发现不同组织中T细胞的组成不一致。肿瘤组织中的CD8+T细胞大部分是耗竭T细胞，而CD4+T细胞则大部分是TNFRSF9+Treg。

为了确定哪些T细胞是潜在的肿瘤反应式T细胞（pTRTs），研究人员对上述类型的T细胞分别计算了数量增殖率（表示数量的多少）和种群扩张率（表示亚群的分布范围），这两个值都很大才能认为某种T细胞是肿瘤反应式T细胞，也就是在肿瘤中种群数量和细胞数量都较大。

经过比较，他们认为TFH/TH1、TNFRSF9+Treg、CD8+ISG+T细胞以及四种Tex细胞属于pTRTs。这也代表了体内抗肿瘤免疫反应的情况。

这些pTRTs属于CD8+的部分中，Tex是主要类型。于是研究人员结合基因表达和TCR数据解析了T细胞耗竭过程的轨迹。

从整体上看，CD8+T细胞是从初始T细胞分化而来，最终变成Temra或者Tex。但是进一步分析Tex的演化分支，他们发现了两条不同的演化路径，一条是初始T细胞到IL7R+记忆T细胞，再到GZMK+T细胞，最后变成终末Tex（P1）；另一条则是IL7R+记忆T细胞到ZNF683+CXCR6+Trm，最后变成终末Tex（P2），这两种演化路径在有的肿瘤样本中甚至同时存在。

之前有假说认为，表达CXCR5和TCF7的祖细胞会造成终末Tex的增加，然而，研究人员在他们的数据中并没有发现这个现象。

接着他们分析了P1和P2这两条路径在不同类型癌症中的普遍性，发现12种癌症中有11种的T细胞是通过P1或者P2转变成Tex的，表明P1和P2是普遍存在的T细胞演化路径。但仍然有不利用P1和P2进行T细胞演化的肿瘤，例如经过Tc17演化的乳腺癌，说明了T细胞演化的异质性。

上面的分析都是通过比较终末Tex和中间态Tex（例如GZMK+Tex）之间TCR相似程度来确定T细胞的演化路径，除此之外，研究人员还比较了终末Tex间与非耗竭状态有关的特征基因的表达模式（同一细胞类型比较）。

他们发现，在卵巢癌中高表达Treg相关转录因子FOXP3的终末Tex，与高表达CD8+Tex相关基因CXCL13的终末Tex存在着类内转化。并且在食道癌和胃腺癌中具有Tc17相关特征的也与表达CXCL13的Tex有着类似的TCR。这些结果都再一次证明了T细胞的演化路径，同时也说明Tex在不同癌症中可能有不同的功能。

那么T细胞的耗竭过程到底是怎么发生的呢？

研究人员把在超过80%的癌症类型中高表达、且编码转录因子的Tex特征基因认定为耗竭相关基因，前十位的基因为TOX、TOX2、RBPJ、ZBED2、PRDM1、VDR、IKZF4、BATF、STAT3、IFI16。其中TOX作为一个早已被识别为T细胞耗竭过程中关键的转录因子，更是在所有癌症类型中都有显着高表达[7]。

尽管Trm和Tem在耗竭过程中有许多共同的上调转录因子（TOX、RBPJ以及ETV1），但是不同的演化路径表达的转录因子是不一样的，例如P1晚期高表达BHLHE40和ZBTB32，而P2晚期则高表达STAT1和IKZF3。

他们还发现了两个之前未被报道的T细胞耗竭相关转录因子——SOX4和FOXP3，表达这两个基因的T细胞比例在不同类型癌症中不一样，表明不同的肿瘤微环境对Tex表型有着不同的影响。

分析完了CD8+T细胞，接着研究人员分析了pTRTs中属于CD4+的部分。这部分细胞中IFNG+TFH/TH和TNFRSF9+Treg是主要类型。单细胞数据的分析结果显示这些类型的T细胞是初始T细胞分别分化而来。

更精细化的分析则发现IFNG+TFH/TH是由IL21+TFH形成，在这个过程中，一型免疫反应相关细胞因子和细胞毒性效应分子的表达量都显着上升，这与之前的研究是一致的[8]。

而Treg的分化过程是从TNFRSF9-到TNFRSF9+的激活过程，与以往报道一致的是，ISG+Treg是中间态细胞类型，说明ISG高表达是CD4+Treg激活过程的重要特征[9]。

研究人员还发现了一些未被报道的TNFRSF9+Treg特征基因，比如在Treg激活轨迹晚期表达的HIVEP1，以往发现的特征基因FOXP3和BATF均是在早期表达。

前面提到过不同肿瘤中T细胞的组成是不同的，研究人员认为癌症类型的不同在很大程度上造成了T细胞组成的差异，例如食管癌中CD8+Tex的中位比例为26.64%，而多发性骨髓瘤中则为0.15%，其他T细胞类型的比例均在不同类型癌症中有着较大差异。

除了癌症类型以外，肿瘤突变负荷甚至一些特定基因（例如FAT1）上的体细胞突变，都能影响T细胞组成。

为了揭示跨癌症类型的T细胞组成总体特征，研究人员计算了肿瘤之间不同T细胞元亚群比例的关系，他们发现有关联的T细胞元亚群通常都有着相似的特征基因。

利用有关联的元亚群之间的特征基因交集，他们识别了基因共有的配体，最终发现TGF-和干扰素可能影响了pTRTs的转录以及在肿瘤中的丰度。

最后，这些有关联的T细胞元亚群的比例，还被研究人员用于将肿瘤样本进行分类，他们把样本分成了8类，分别为C1到C8。其中C1和C2的Tex比例更高，C1还有最高比例的TNFRSF9+Treg。C3到C8中的Tex比例较低，而CD8+ZNF683+CXCR6+Trm比例较高。(生物谷Bioon.com）