PNAS：癌细胞竟有“金钟罩铁布衫”！

近些年，肿瘤免疫治疗可谓如日中天，欣欣向荣。然而免疫治疗的关键在于解决肿瘤的免疫逃逸问题，然后诱导自身免疫系统清除肿瘤。比如大名鼎鼎的PD-1/PD-L1就是一对表达在免疫细胞和癌细胞上的蛋白，这条信号通路抑制了免疫细胞对癌细胞的识别，帮助肿瘤实现免疫逃逸。PD-1/PD-L1抗体药物便是通过破坏这条通路掐灭癌细胞逃跑的企图，然后癌细胞就只能被T细胞打得溃不成军。

然而道高一尺，魔高一丈。迷惑T细胞的“幻术”已经被识破，但最近科学家们又发现了癌细胞的新招——“金钟罩铁布衫”，这让T细胞近不得身，就算有浑身解数也无处使。

近期来自美国纽约冷泉港实验室癌症中心、康奈尔大学医学院爱德华·梅耶癌症中心的Douglas T Fearon教授团队于PNAS上发表研究成果[2]。他们发现癌细胞披上“CXCL12-KRT19”外衣，就如同金钟罩铁布衫，阻挡T细胞进入肿瘤，从而使PD-1免疫疗法无计可施。

事实上，大多数实体瘤的T细胞浸润率都非常低，所以像针对T细胞的免疫检查点一类的疗法通常会无从下手。上述现象一般被认为是由于癌细胞对肿瘤微环境的改造，从而限制瘤内T细胞集聚，但还有一种免疫学观点认为趋化因子/趋化因子受体系统亦能调控免疫细胞的流向[3]。

此前有相关研究发现，在患有微卫星稳定型胰腺癌和结直肠癌的小鼠和病人中，CXCR4抑制剂AMD3100可以增强瘤内活化T细胞的集聚效应，并且科学家们注意到这些癌细胞表面覆盖有CXCR4的配体蛋白CXCL12[4，5]，所以科学家们推测这类癌细胞身上蕴藏着利用免疫趋化因子进行免疫逃逸的秘密。若能了解这类癌细胞究竟为何且如何披上了“CXCL12”的外衣，或许能顺藤摸瓜找到肿瘤抑制T细胞浸润且逃避T细胞免疫攻击的秘密。

受此启发，Fearon教授团队将微卫星稳定型胰腺癌（MSS-PDA）、微卫星稳定型结直肠癌（MSS-CRC）和乳腺癌（BC）的病人切除的组织进行冷冻切片，观察到组织中KRT19（内皮细胞的特征蛋白）阳性的细胞同时也有CXCL12的阳性。他们经过提取分离，再用免疫手段应证，发现CXCL12均与KRT19以共价结合的形式存在于在这些癌细胞中。

鉴于已有文献观察到CXCL12是覆盖在细胞表面的，研究者们便找来会外露表达KRT19的SKBR2乳腺癌细胞系和Caco2结直肠癌细胞系，看细胞是否在表面覆盖了CXCL12-KRT19结合物。通过共聚焦观察发现，CXCL2、KRT19共定位于外泌细胞丝形成的网状结构上，且不存在单阳性的现象。这说明，CXCL12可与KRT19共价结合成二聚体，并形成了网状的细胞“外衣”结构。

然而癌细胞无法凭空整出来一副“金钟罩”，细胞里定还有第三个蛋白酶负责促成这个二聚体结合物形成。

研究者们注意到了TGM2（人转谷氨酰胺酶2）这个蛋白。在体外环境下，TGM2可以介导CXCL12-KRT19二聚体的形成，而加入TGM抑制剂ERW041E可以阻碍二聚体的形成。这说明了TGM2是CXCL12-KRT19“外衣”的形成的关键。

凭借以上体外实验，我们仅可猜测在实际治疗中，通过干预KRT19和TGM2或可阻止CXCL12-KRT19“金钟罩”的形成，促使T细胞“直捣”癌细胞老巢。

为了在体内验证这个结论，研究者在小鼠皮下注射PDA癌细胞让其形成肿瘤，以此作为疾病模型作进行实验研究。如预想一般，研究者们观察到肿瘤细胞覆盖着CXCL12-KRT19“外衣”，并且可以能够分离沉淀下来CXCL12-KRT19的复合物。

然后研究者们将PDA癌细胞中的KRT19基因利用CRISPR/Cas9技术进行编辑，拥有完整KRT19基因的癌细胞的对照组可以观察到KRT19和CXCL12蛋白的表达，而且瘤内几乎看不到成熟的T细胞。编辑过的实验组则看不到KRT19或CXCL12阳性的细胞，同时成熟的T细胞随处可见。而且在编辑过的细胞中导入外源KRT19后，又可以观察到对照组的实验现象。以上说明，KRT19的缺位，导致CXCL12-KRT19 “外衣”消失，浸润的T细胞增加，肿瘤生长更缓慢，也就验证了对KRT19功能的猜想。

研究者通过同样的方法，编辑PDA癌细胞中的TGM2基因，缺少癌细胞中TGM2基因，就无法形成CXCL12-KRT19“外衣”，T细胞的浸润率也随之提高，肿瘤生长速度减慢；而导入外源TGM2基因表达后，则可以表达CXCL12-KRT19“外衣”，赶走T细胞，肿瘤快速生长。所以，TGM2也是干预CXCL12-KRT19“外衣”形成的又一关键。

此外，CXCL12-KRT19这层外衣即使在微卫星不稳定，免疫原性高的情况下亦可抵抗T细胞的入侵。

最后研究者们检验了一下拥有CXCL12-KRT19“外衣”的癌细胞是否可以抵挡PD-1免疫疗法的攻击。

他们选择在治疗难度更高，但与PDA肿瘤微环境相似的肝转移PDA肿瘤模型上进行这个实验。同样通过CRISPR手段对癌细胞的KRT19或TGM2基因进行了编辑，有CXCL12-KRT19“外衣”的肿瘤，在注射PD-1抗体药物后，依旧我行我素，而没有“外衣”的肿瘤的扩散则受到了抑制。因此，说明CXCL12-KRT19“外衣”可直接影响杀伤性T细胞在的瘤内集聚和肿瘤对PD-1抗体药物的敏感性。（生物谷Bioon.com）