研究人员建立在体高通量谱系示踪新技术

7月17日，《自然-方法》在线发表了中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心、神经科学国家重点实验室陈跃军研究组撰写题为《利用CRISPR条形码技术全面绘制小鼠脑内的单细胞时空谱系》的研究论文。该研究通过建立能够应用于小鼠体内任意组织器官的谱系示踪新技术——CREST，解析了小鼠中脑在胚胎发育过程中的单细胞时空谱系图谱，揭示了小鼠中脑发育过程中新的谱系分化路径和分子调控机制。CREST技术为高通量解析小鼠组织器官发育的单细胞谱系提供了全新的工具，为从谱系视角研究各种发育疾病的发病机制提供了新的研究工具。

哺乳动物的发育伴随高度复杂的细胞命运特化过程——从多潜能干细胞逐步分化成熟为各种类型的细胞，进而形成高度异质性的组织器官。解析每个细胞在这一过程中的完整发育历程（即“谱系”）是发育生物学领域的重要目标之一。谱系的研究有助于探索生命个体的发育，解析发育相关疾病的发病机制，并为基于细胞治疗的再生医学研究中不同类型细胞药物的体外分化和制备，提供关键依据和线索。

近年来，人们为解析哺乳动物神经系统的谱系做出了努力。然而，传统基于重组酶技术的谱系示踪通量有限，一般只能示踪1-2个谱系。近来有研究通过在侧脑室注射条形码标记的病毒，对脑室区（Ventricular Zone，VZ）的神经干细胞进行标记，并结合单细胞测序对这些细胞的子代细胞进行高通量谱系示踪。然而，这种方法只能标记VZ区的神经干细胞，无法实现对全脑任意脑区神经干细胞的标记，同时用病毒注射的方法标记早期胚胎中的细胞存在技术障碍。因此，亟需开发能够对脑内任意细胞群体进行高通量条形码标记和谱系示踪的新方法。 

陈跃军团队针对上述问题，通过将CRISPR条形码技术、重组酶系统和单细胞测序技术相互结合，开发了一种在体高通量谱系示踪的方法——CREST，并构建了相应的谱系示踪工具小鼠品系（图A）。利用CREST技术，研究团队绘制了较全面的中脑发育谱系图谱，有助于剖析中脑多种类型细胞的发育过程。

研究团队利用基于CREST的“快照”策略（snapCREST），解析了特定发育时间点中脑不同细胞类型之间的谱系关系（图B），发现了较多未被报道的具有亚区特异性的谱系关系，即在翼板中，谷氨酸能神经元与GABA能神经元具有共同的谱系起源；而在基板中，这两类神经元具有相对独立的起源；在底板中，谷氨酸能神经元则与多巴胺能神经元具有共同的起源（图C）。研究团队进一步在克隆水平对祖细胞的分化命运进行了无偏好的分类，发现单个中脑祖细胞的分化命运可以被分为六种主要类型。基于这一结果，研究团队提出了“祖细胞原型”的概念。这六种中脑祖细胞原型囊括了中脑发育过程中单个中脑祖细胞的不同分化命运（图D）。研究进一步在克隆水平对中脑底板神经祖细胞的分化命运进行分析，发现单个中脑底板神经祖细胞存在三种不同的分化命运，即中脑底板神经祖细胞经由中脑底板神经母细胞，有的偏好分化成多巴胺能神经元，有的偏好分化成谷氨酸能神经元、有的则能同时分化成多巴胺能和谷氨酸能神经元。研究通过对不同分化命运的底板神经母细胞差异表达基因的分析发现，Pbx1转录因子在偏好产生多巴胺能神经元的底板神经母细胞内显著高表达（图E）。当Pbx1被敲除后，共释放谷氨酸的中脑多巴胺能神经元的比例显著增加，这证明Pbx1在决定中脑底板来源神经元的谷氨酸能表型和多巴胺能表型中的关键作用（图F）。这展示了CREST技术在克隆水平解析细胞命运决定分子机制中的能力。

snapCREST可以解析特定发育时间点不同细胞类型之间的谱系关系，但由于祖细胞在被用于单细胞测序后无法继续分化，这一策略无法解析不同祖细胞类型在下一阶段的分化命运。为此，研究进一步开发了基于CREST的“连拍”策略（pandaCREST）。该策略结合了克隆分离策略、类器官培养技术与CREST技术，实现了发育过程中单个祖细胞转录组信息及其分化潜能的同时获得（图G）。通过pandaCREST，研究解析了中脑不同转录组定义的祖细胞群的分化命运。进一步的单克隆分析发现，在同一转录组定义的祖细胞群内，单个祖细胞具有不同的分化命运，且在转录组水平上，不同分化命运的祖细胞仍存在微小的差异，提示同一祖细胞类群内单个细胞的不同分化命运是预先确定的（图H）。

CREST技术是一种高通量谱系示踪的新方法。它不仅可以在单细胞水平解析体内的发育谱系，而且可以在克隆水平解析发育过程中命运决定的分子机制，是目前已知的唯一可以对脑内任意细胞群体进行高通量谱系示踪的方法，为解析全脑发育谱系图谱提供了关键技术。通过将CREST小鼠与任意组织器官或特定类型细胞的Cre/CreER小鼠交配，CREST技术可以被广泛地应用于其他组织器官的发育谱系研究，并可以用于疾病、损伤或再生条件下的谱系研究。这为在单细胞和单克隆水平研究不同组织器官的发育和疾病发生提供了通用技术方法。

研究得到中国科学院、科学技术部、国家自然科学基金委员会和上海市科学技术委员会的支持。

脑智卓越中心建立在体高通量谱系示踪新技术