Mol Cell | 周宇课题组揭示RNA渐进式加尾调控m6A修饰的功能和机制
来源：生物探索 2024-08-14 10:53
该研究提出了渐进式多聚腺苷酸化与核滞留共同决定转录后m6A修饰的新机制。
哺乳动物中超过70%的蛋白编码基因具有多个polyA位点，不同polyA位点的选择被称为可变多聚腺苷酸化（Alternative polyadenylation，APA）【1】。之前的研究认为，APA发生过程中近端polyA位点和远端polyA位点的加工都是共转录发生的，二者相互独立。武汉大学周宇课题组和付向东教授合作于2022年发现了“渐进式可变多聚腺苷酸化（Sequential polyadenylation，SPA）”的加工新模式：远端强polyA位点优先被选择产生长3′UTR转录本，继而在近端弱polyA位点进一步切割，产生短3′UTR转录本释放到细胞质【2】。
但这种新型的渐进式可变加尾的生物学意义尚不明确。m6A作为mRNA内部最丰富的RNA修饰，在发育、免疫等过程发挥了重要的作用。在分子水平上，m6A在细胞核内调控了RNA的剪接和APA。但目前关于m6A修饰和RNA加工相互调控关系的数据和模型存在一定的冲突，例如m6A修饰水平和RNA的3′UTR长度呈正相关，但同一个基因的短3′UTR转录本，而不是长3′UTR转录本，选择性地被m6A所修饰。
武汉大学周宇教授团队在Molecular Cell在线发表了题为Nuclear retention coupled with sequential polyadenylation dictates post-transcriptional m6A modification in the nucleus的研究论文。该研究发现，远端polyA位点加工产生的长3′UTR转录本会被m6A修饰复合物在转录后进一步修饰，而通过sequential polyadenylation，m6A修饰水平更高的短3′UTR转录本被释放到细胞质。
在前期的研究中，作者观察到长3′UTR转录本会滞留于nuclear speckles（核斑）。考虑到m6A修饰复合物的组分也在nuclear speckles富集，作者提出假设：滞留于nuclear speckles的长3′UTR转录本会进一步在转录后发生m6A修饰，从而造成m6A修饰水平和RNA的3′UTR长度呈正相关；而通过sequential polyadenylation的第二步切割，则会造成同一个基因的短3′UTR转录本而不是长3′UTR转录本被m6A所修饰。由于以前的报道认为m6A修饰主要是共转录发生的，作者首先鉴定了m6A修饰能否在转录后进一步发生？为此，作者在前人开发的m6A-LAIC-seq【3】和GLORI【4】的基础上，结合新生RNA标记技术，开发了4sU-m6A-LAIC-seq和4sU-GLORI方法。通过比较新生（nascent）RNA，包括无polyA尾和带有polyA尾的新生RNA，以及稳定状态（steady-state）下的RNA的m6A水平，作者发现转录后m6A修饰是一个普遍的现象（图2），而且相比较于未发生转录后m6A修饰的RNA，发生转录后m6A修饰的RNA在稳定状态下m6A修饰水平更高。
进一步，作者为了证明RNA的核滞留能够增强m6A修饰水平，一方面构建了HBB-gDNA（含有intron）和HBB-cDNA（不含intron）报告质粒：两个reporter最终产生的RNA序列完全一样，但只有HBB-gDNA来源的RNA能够有效转运出核，而HBB-cDNA来源的RNA则会滞留于细胞核内；另一方面，利用AID2系统对mRNA转运出核因子NXF1进行快速降解以诱导mRNA核滞留。
随后，分别对Reporter来源的 RNA和内源基因来源的RNA进行GLORI定量。单个reporter和转录组规模的实验结果都证明了RNA的核滞留确实能够提高m6A的修饰水平，这也暗示着长3′UTR也有可能通过RNA核滞留增强m6A修饰水平。鉴于渐进式可变多聚腺苷酸化的发生是由于近端polyA位点弱于远端polyA位点，作者进一步通过改变近端polyA位点的强度以破坏或保留渐进式可变多聚腺苷酸化的发生，得到的实验结果进一步表明渐进式可变多聚腺苷酸化可以促进m6A修饰。
渐进式多聚腺苷酸化与核滞留共同决定转录后m6A修饰(Credit: Molecular Cell)
综上，该研究提出了渐进式多聚腺苷酸化与核滞留共同决定转录后m6A修饰的新机制：在渐进式多聚腺苷酸化过程中，远端polyA位点加工产生的长3′UTR转录本滞留于细胞核内，额外的核滞留时间使得m6A修饰复合物可以在转录后对mRNA继续进行修饰，从而进一步提高其m6A修饰水平（图2）。该研究为理解m6A等修饰与APA调控提供了新思路，为解决领域冲突提供了新视角。
1. Tian and Manley, Alternative polyadenylation of mRNA precursors. Nat Rev Mol Cell Biol 18:18-30 (2017)
2. Tang et al., Alternative polyadenylation by sequential activation of distal and proximal PolyA sites. Nat Struct Mol Biol 29: 21-31 (2022)
3. Molinie et al., m6A-LAIC-seq reveals the census and complexity of the m6A epitranscriptome. Nat Methods 13, 692–698 (2016)
4. Liu et al., Absolute quantification of single-base m6A methylation in the mammalian transcriptome using GLORI. Nat Biotechnol 41: 355–366 (2023)
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