《自然》子刊：癌细胞“以柔克刚”，物理免疫检查点“横空出世”！

免疫治疗发展迅速，重磅研究层出不穷。在和恶性肿瘤斗智斗勇的过程中，研究者们逐渐发现部分恶性肿瘤可以通过多种途径抵抗免疫治疗药物的作用，影响细胞过继疗法的效果。

由于细胞外基质蛋白的异常产生和交联，肿瘤组织通常比正常组织更硬，但单个肿瘤细胞通常比非恶性肿瘤细胞更软。细胞柔软度是一种生物力学特性，目前研究已经证明，肿瘤细胞的硬度降低与癌细胞的转化、恶性和转移有关。

近日，来自瑞士洛桑联邦理工学院的唐力教授和Mahmut Selman Sakar教授领衔研究团队在Nature Biomedical Engineering上发表了重要研究成果。他们发现肿瘤细胞膜胆固醇富集，硬度减低，对T细胞介导的细胞毒性产生抵抗；胆固醇耗竭可增加肿瘤细胞硬度，继而增强T细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用[4]。

该研究首次提出了物理免疫检查点的概念，扩展了免疫检查点的范畴，这一新的发现可用于新一代靶向治疗的开发，提高肿瘤免疫治疗的有效性。

目前研究人员寻找新的免疫检查点的工作主要在生物化学信号方面，涉及生物力学信号方面的潜在抑制途径的研究较少，如靶细胞硬度等。研究证明，肿瘤细胞硬度的降低是由于细胞骨架网络和质膜的软化[5]。靶细胞表面的物理特性可能会影响肿瘤细胞与T细胞间的相互作用[6]。然而，癌症细胞硬度在逃避免疫监测中的作用仍不明确。

T细胞可以在免疫突触上施加力量，增强对靶细胞的细胞毒性[7]。当T细胞接触到表面硬度较低的基质表面或靶细胞时，细胞骨架力和效应细胞因子的产生大大减少[8，9]。受这些研究结果的启发，研究人员假设肿瘤细胞利用细胞硬度减低作为一个物理免疫检查点，通过削弱T细胞的机械力来抵抗T细胞介导的细胞毒性。

研究人员首先通过Filipin III染色和胆固醇含量检测，证明了小鼠和人类肿瘤组织及从这些组织中分离出来的肿瘤细胞、小鼠T淋巴瘤细胞系的胆固醇水平显着增高。

甲基化-β-环糊精（MeβCD）是一种在临床中广泛使用的药物增溶剂，有报道称其可以清除胆固醇。体内体外实验证明，MeβCD可以降低肿瘤细胞质膜胆固醇富集，但对癌细胞的生存能力和凋亡没有直接影响。

为了检验膜胆固醇水平是否影响肿瘤细胞的力学特性，研究人员使用多种方法测量细胞硬度后发现，与未处理的细胞相比，添加胆固醇的细胞表面硬度显着降低、变形性显着增加，而胆固醇耗竭则可显着增加细胞表面硬度。这些结果表明，在质膜上增加胆固醇有助于肿瘤细胞软化，通过MeβCD干预耗竭胆固醇可以增加肿瘤细胞的硬度。

研究团队接下来探究了细胞的硬度降低后，是否对T细胞介导的细胞毒性产生抵抗。他们将B16F10癌细胞接种在不同硬度的水凝胶上，与活化的Pmel CD8+ T细胞（能够特异性识别黑色素瘤B16F10肿瘤细胞的gp100抗原）共培养。

体外实验证明，当添加外源胆固醇时，B16F10细胞的存活率较高，表明肿瘤细胞硬度降低可以作为一种物理抑制途径，影响T细胞介导的杀伤作用。体内实验验证了这一结果，值得注意的是，单独服用胆固醇对治疗小鼠的肿瘤生长或存活率没有影响。

为了研究了这种物理免疫检查点是否可以通过增强肿瘤细胞硬度来抑制。研究人员制备了ACAT1过表达的B16F10癌细胞（ACAT1 OE B16F10），其膜胆固醇水平比天然B16F10细胞低70%。这种细胞硬度更高，对T细胞介导的细胞毒性表现出更高的敏感性。体内实验表明Pmel CD8+ T细胞更好地控制了ACAT1 OE B16F10肿瘤细胞的生长。携带ACAT1 OE B16F10肿瘤的小鼠也显示了延长的生存期。

在这些发现的基础上，研究人员尝试开发一种可以增加肿瘤细胞硬度的干预方式，以增强癌症免疫治疗效果。MeβCD处理的B16F10细胞，在处理后5小时内可保持较低的膜胆固醇水平，且经MeβCD预处理硬化的肿瘤细胞对T细胞介导杀伤作用的敏感性显着增加。在动物实验中发现，在不同肿瘤中，联合MeβCD干预后，Pmel CD8+ T细胞过继治疗单用或与IL-15超级激动剂（IL-15SA）联用的治疗效果都得到增强。

值得注意的是，MeβCD干预没有引起体重下降、脾肿大、脾脏中CD8+ T细胞浸润和活化增加等副作用。MeβCD单独作为一种治疗方法没有治疗效果，表明抗原特异性细胞毒T细胞的存在是杀伤硬度增加的靶细胞的必要条件。

此外，细胞介导的细胞毒性的生化途径，如Fas蛋白与Fas配体相互作用， IFN-γ和TNF-α等效应细胞因子的分泌，以及溶细胞蛋白（如穿孔素和颗粒酶）的颗粒胞吐等，未受肿瘤细胞硬化的影响。

据报道，富脯氨酸酪氨酸激酶2（Pyk2）的磷酸化与原代T细胞施加的细胞力呈正相关。研究人员通过在不同硬度水凝胶进行实验，证明Pmel CD8+ T细胞在较硬的表面产生更高的机械应力，与细胞硬度增强的肿瘤细胞共培养时，Pmel CD8+ T细胞能诱导更高水平的pPyk2。这些结果表明T细胞对硬化的肿瘤细胞施加了更强的细胞力。

简单来讲，本研究发现细胞硬度减低可作为一种物理免疫检查点。通过消耗肿瘤细胞质膜胆固醇使癌细胞硬度增加，可以抑制这一物理免疫检查点作用，增强T细胞介导的杀伤作用，提升免疫治疗的效果。(生物谷Bioon.com）