华人科学家在肝癌早筛早诊上取得新突破

全球范围内，肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）在肿瘤中的发病率排在第六，但死亡率却高居第三[1]。肝癌预后差的主要原因是其起病隐匿，多数在晚期确诊，因此早发现能给早治疗争取宝贵的时间窗口，显著改善患者预后。

肝癌的发病大多遵循肝炎－肝硬化－肝癌的“三步曲”模式，肝硬化患者是肝癌最主要的高危人群，在肝硬化人群中及早发现肝癌，是当前肝癌早筛的重中之重。目前对肝癌高危人群早筛的方法是肝脏超声检查和血清甲胎蛋白（AFP）监测，但敏感性不超过70%，准确率差强人意[2]。

因此，寻找兼具高敏感性和高特异性的肝癌新型诊断标志物，对于肝癌的防治至关重要。

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是细胞释放的纳米囊泡状小体，含有脂质、核酸和蛋白质等内容物，具有组织来源和疾病特异性，因此具有成为生物标志物的潜力。且EVs在癌症发生早期就已出现在血液和体液中，用液体活检对肿瘤来源的EVs进行检测，以实现癌症的早诊断，具有很高的可行性。已有研究发现，基于EVs的lncRNA和mRNA等标志物，能很好地区分早期肝癌和肝硬化[3]。

近日，加州大学洛杉矶分校（UCLA）的曾宪荣教授和朱亚珍教授，联合洛杉矶雪松-西奈医疗中心的临床团队，从早期肝癌患者和肝硬化患者的外周血中分离EVs，开发并优化了HCC特异性EV表面蛋白检测方法，从而建立了一套全新的HCC早筛模型，区分早期HCC和肝硬化的准确性超过93%（AUC>0.93），检测性能优异[4]。研究成果已在线发表于肝病学顶级期刊Hepatology。

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疾病检测模型的诊断性能取决于标志物的特异性。为了找到合适的HCC EVs特异性蛋白标志物，研究人员首先在HCC组织、HCC细胞株来源EVs和HCC患者外周血来源EVs中进行了标志物的筛查与验证。

肿瘤来源EVs的蛋白往往与肿瘤细胞的蛋白呈表达正相关。既往研究发现EpCAM、CD147、GPC3和ASGPR1在HCC中高表达[5]，因此，研究人员选择这四种蛋白作为HCC EVs的候选标志物进行检测。

HCC组织芯片结果显示，高达99.7%的HCC患者至少有一种标志物呈阳性，其中，24.6%的患者四个标志物都呈阳性，47.7%的患者任意三个标志物呈阳性，24.6%的患者任意两个标志物呈阳性。这四种蛋白标志物在HCC组织中的表达呈互补性，提示这四种蛋白作为标志物组合，在HCC诊断上可能具有卓越的优势。

免疫组化（图A）检测EpCAM、CD147、GPC3和ASGPR1这四种蛋白标志物在含有708例HCC的组织芯片上的表达；饼图（图B）和柱状图（图C）统计蛋白标志物在HCC组织中的阳性表达率；免疫印迹（图D）检测候选HCC EVs表面蛋白标志物表达：HepG2, Hep3B和Huh-7是人HCC细胞株，作为实验组，MIHA是永生化的人肝细胞株，Primary human hepatocyte是人肝细胞，作为对照组，BSA是胎牛血清白蛋白溶液，作为空白对照组

同时，研究人员在HCC细胞株来源EVs，对候选蛋白标志物进行了表达验证。免疫印记结果显示，这四种蛋白在HCC细胞株来源的EVs上表达齐全，且表达量远高于正常肝细胞来源的EVs，提示它们可以作为检测HCC EVs的特异性标志物。

HCC EVs除了表达EpCAM、CD147、GPC3和ASGPR1这四种特异性蛋白标志物外，还表达EVs普遍表达的CD63和CD9这两种通用生物标志物。基于特异性和通用标志物，研究人员把HCC EVs分为EpCAM+ CD63+ HCC EVs、EpCAM+ CD9+ HCC EVs等八种亚群。

接着，研究人员招募45名早期HCC患者和61名匹配的肝硬化患者组成训练队列，在训练队列中检测HCC EVs亚群表达。结果显示，与肝硬化组相比，早期HCC组的八个HCC EVs亚群含量明显更高，尤其是基于CD63的四个HCC EVs亚群。

研究人员构建逻辑回归模型，对HCC EVs亚群的诊断性能进行分析。ROC曲线显示，这八个亚群中，基于CD63的亚群的诊断效能普遍高于基于CD9的亚群，其中，EPCAM+ CD63+ HCC EVs，CD147+ CD63+ HCC EVs和GPC3+ CD63+ HCC EVs这三个亚群与早期HCC高度相关。

因此，研究人员整合这三个亚群，构建成早期HCC诊断模型，并根据首字母缩写将模型命名为HCC EV ECG评分。在训练队列中，HCC EV ECG评分对早期HCC和肝硬化的鉴别表现出极高的准确性，AUC为0.95；在评分=-0.4的最佳cut-off值处，对早期HCC检测的敏感性达到91%，特异性达到90%，阳性预测值和阴性预测值分别达到87%和93%！

随后，研究人员收集35名早期HCC患者和37名匹配的肝硬化患者组成验证队列，在验证队列中对HCC EV ECG评分的检测性能进行验证。结果显示，HCC EV ECG评分区分早期HCC和肝硬化的性能依然优秀，AUC为0.93，敏感性为91%，特异性为81%。

研究人员又比较了早期HCC和中晚期HCC、乳腺癌、前列腺癌及甲状腺癌的HCC EV ECG评分，发现HCC患者的HCC EV ECG评分显著高于其他癌症患者，证实了HCC EV ECG评分对HCC，而非其他癌症的诊断特异性。

最后，研究人员评价了HCC EV评分在HCC不同病因亚组和危险分层中的诊断性能。HCC EV评分在病毒性肝炎引起的HCC患者中AUC达到0.95，在非病毒性病因HCC患者中的AUC为0.94，都表现出了精准识别早期HCC区分肝硬化的卓越检测能力；在米兰标准内的早期HCC患者中，HCC EV ECG评分也表现出色，AUC为0.93，90%的敏感性下特异性达到87%。

就病因而言，除病毒性肝炎外，HCC还存在酒精性肝病等非病毒性因素，不同病因的HCC在临床特征和预后等方面也不尽相同[6]。就治疗而言，米兰标准是当前公认的肝移植适应证，因此识别米兰标准内的早期HCC也有一定临床价值。

综上所述，研究人员通过分离外周血EVs，检测HCC EV表面蛋白，基于三种HCC EV亚群，开发出一个早期HCC的检测模型，并在早期HCC和肝硬化患者中彰显出精准识别HCC的卓越性能，简便，准确，快速，有望提高HCC的早筛效率，改善早期HCC患者的预后。

然而本研究也还存在一些局限性，如入组的早期HCC和肝硬化患者例数过少，而且并未纳入健康人群，可能会让这个早筛模型的应用受到限制。另外，在实验材料的选择上本研究也不尽完善，比如在HCC组织芯片上对候选蛋白标志物进行表达验证时，还应该同时在肝硬化和正常肝组织上进行检测，以作为对照。期待后续的前瞻性临床研究，进一步验证HCC EV评分的实用价值。

参考文献：

[1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi:10.3322/caac.21660

[2] Marrero JA, Kulik LM, Sirlin CB, et al. Diagnosis, Staging, and Management of Hepatocellular Carcinoma: 2018 Practice Guidance by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 2018;68(2):723-750. doi:10.1002/hep.29913

[3] Sun N, Lee YT, Zhang RY, et al. Purification of HCC-specific extracellular vesicles on nanosubstrates for early HCC detection by digital scoring. Nat Commun. 2020;11(1):4489. Published 2020 Sep 7. doi:10.1038/s41467-020-18311-0

[4] Sun N, Zhang C, Lee YT, et al. HCC EV ECG Score: An Extracellular Vesicle-based Protein Assay for Detection of Early-Stage Hepatocellular Carcinoma [published online ahead of print, 2022 Jul 31]. Hepatology. 2022;10.1002/hep.32692. doi:10.1002/hep.32692

[5] Court CM, Hou S, Winograd P, et al. A novel multimarker assay for the phenotypic profiling of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. Liver Transpl. 2018;24(7):946-960. doi:10.1002/lt.25062

[6] Karim MA, Singal AG, Kum HC, et al. Clinical Characteristics and Outcomes of Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in the United States [published online ahead of print, 2022 Mar 17]. Clin Gastroenterol Hepatol. 2022;S1542-3565(22)00284-1. doi:10.1016/j.cgh.2022.03.010