Nature子刊：李兵辉团队发现癌症的阿喀琉斯之踵——嘧啶小体

在增殖细胞中，嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸可以通过回收途径回收或从头途径合成。所有催化嘌呤从头生物合成的六种酶都可以形成一种被称为“嘌呤小体”的多酶复合物来调节嘌呤通量。

嘧啶的从头合成由3种代谢酶催化的6种化学反应组成，分别为位于胞质的CAD、锚定于线粒体内膜的二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）以及胞质的尿苷5'-三磷酸合成酶（UMPS）。前三个步骤由多功能蛋白CAD催化合成二氢乳清酸（DHOA）。DHODH介导DHOA转化为乳清酸（OA），最后通过双功能酶UMPS转化为尿苷单磷酸（UMP）。作为CAD的直接前体，人体血液中的天冬氨酸水平很低，它主要由胞质谷氨酸草酰乙酸转氨酶1（GOT1）和线粒体的GOT2主动合成。因为催化嘧啶合成的酶并不是都在细胞质中，即使已有证据表明嘧啶合成中的单个代谢酶能发生聚集，但是否存在嘧啶小体以及其调控机制和生理功能尚不清楚。

2023年6月8日，首都医科大学附属北京佑安医院/北京肝病研究所李兵辉课题组在 Nature Cell Biology 期刊发表了题为：De novo pyrimidine biosynthetic complexes support cancer cell proliferation and ferroptosis defense 的研究论文。

该研究发现，参与嘧啶从头合成的代谢酶会形成一个多酶复合体调控嘧啶合成通量，称为“嘧啶小体”，同时发现嘧啶小体可由能量应激关键蛋白AMPK调控，在肿瘤细胞增殖和铁死亡抵抗中发挥的重要作用。

该研究揭示了嘧啶小体在调控嘧啶代谢流和铁死亡抵抗中的作用，并为针对嘧啶小体的肿瘤治疗策略开发提供理论依据。

首先，研究团队在HeLa细胞中分别敲低了GOT1和GOT2，并利用代谢质谱分析观察嘧啶的合成情况，发现尽管两个酶之间存在互补关系，但相比于GOT2，敲低GOT1的细胞中嘧啶合成通路中被标记的代谢物水平明显下降，说明GOT1在将谷氨酰胺转化到天冬氨酸和嘧啶中起到更关键的作用。之后，研究团队在细胞中补充标记的天冬氨酸并示踪，发现细胞优先利用新合成的天冬氨酸参与到嘧啶从头合成之中。

那么发生这种现象的原因为何呢？研究团队猜想GOT1是否与CAD存在紧密联系。通过实验发现GOT1不仅与CAD存在相互作用，同时也能与DHODH和UMPS结合。说明，参与嘧啶合成的酶作为一个多酶复合体发挥功能。

DHODH是存在与线粒体中的蛋白，又是如何与其他位于胞质中的组分相互作用呢？研究团队发现阴离子DHOA作为CAD的产物以及DHODH的底物，穿梭于线粒体与细胞质，而线粒体膜上存在阴离子通道如VDAC家族。通过实验发现VDAC3与嘧啶合成途径中的代谢酶都存在相互作用。同时，研究团队分离出完整的线粒体，检测到CAD与UMPS存在于线粒体外膜上。此外，VDAC3敲除明显降低了CAD与DHODH和UMPS的相互作用。因此，VDAC3作为一个平台，通过线粒体外膜整合嘧啶生物合成复合体，为DHOA和OA提供内部通路。至此，研究团队发现用于嘧啶合成的代谢酶CAD、UMPS、VDAC3、DHODH和GOT1形成了一个复合体，命名为“嘧啶小体”（Pyrimidinosome）。

研究团队在代谢组学结果中发现，乏氧条件下增强了细胞的DHOA和OA，而降低了UMP的生成，同时乏氧促进了嘧啶小体各组分间的结合。那么是否存在嘧啶小体的调控呢？作者从CAD和DHODH的蛋白质谱结果中鉴定出AMPKα1，并通过Co-IP验证了相互作用。结果显示，AMPKα1与嘧啶小体的所有组分之间的相互作用在乏氧时被减弱，AMPKα1/2-敲除明显增强了组分间的相互作用。说明AMPK被激活后与嘧啶小体结合减弱，嘧啶小体本身结合增强，因此使得嘧啶核苷酸的前体合成是增强的。

AMPK作为激酶能够使底物发生磷酸化，进而调控底物活性。作者发现，UMPS可作为AMPK的底物被磷酸化进而抑制其代谢活性。通过质谱鉴定出UMPS的磷酸化位点为S214，同时制备了位点特异性磷酸化抗体。乏氧、AMPK激活剂处理促进了UMPS S214的磷酸化，而在AMPK敲除细胞中完全消除。以上结果表明AMPK通过失活UMPS将嘧啶代谢通量阻止于OA的生成，说明DHODH介导的代谢转换可能在拮抗AMPK相关应激中发挥了关键作用。

DHODH将电子传递到辅酶Q（CoQ），并保持其还原形式（CoQH2），以此抵抗铁死亡。当缺失CAD、DHODH或VDAC3时，铁死亡抑制剂ferrostatin-1可以部分营救细胞并联合尿苷挽救细胞死亡，说明嘧啶小体除了在嘧啶合成中发挥作用，还参与到抵抗铁死亡之中。研究团队通过联合使用AMPK的激活剂和DHODH的抑制剂，以及敲低嘧啶小体的组分进行了铁死亡相关的研究，在细胞生长以及裸鼠成瘤实验中均发现嘧啶小体的存在的确能够使细胞抵抗铁死亡，尤其是面临诱导AMPK激活的压力情况下。最后，研究团队发现在AMPK敲除或低表达时，肿瘤细胞中的嘧啶核苷酸代谢更加旺盛，因此这类细胞更加依赖于嘧啶小体介导的嘧啶合成。

综上所述，该研究发现了细胞质中的GOT1、CAD及UMPS结合一起，并通过线粒体外膜蛋白VDAC3和锚定在内膜的DHODH形成嘧啶小体（Pyrimidinosome）。AMPK是嘧啶小体调控的重要因子，应激条件下AMPK被激活后与嘧啶小体结合减弱并离开，从而提高各组分的结合，促进嘧啶核苷酸前体的合成，但AMPK同时抑制UMPS的活性，导致终产物UMP下降。这样能确保通过DHODH生成CoQH2抑制应激条件下的铁死亡。因此，AMPK激活剂能提高肿瘤细胞对DHODH抑制剂的敏感性。同时，如果细胞表达低水平的AMPK，则使细胞更依赖嘧啶从头合成，这类细胞对DHODH抑制更敏感。该项研究揭示了嘧啶小体在调控嘧啶代谢流和铁死亡抵抗中的作用，并为针对嘧啶小体的肿瘤治疗策略开发提供理论依据。

值得一提的是，Nature Cell Biology 期刊同期配发评论文章：The pyrimidinosome is cancer's Achilles' heel（嘧啶小体是癌症的阿喀琉斯之踵），认为该发现毫无疑问是ground-breaking的进展，有望为肿瘤的靶向治疗带来革命。

首都医科大学附属佑安医院/北京肝病研究所李兵辉教授为论文通讯作者，首都医科大学基础医学院杨传真老师，博士研究生赵一亮、博士生王燎为论文共同第一作者。首都医科大学研究生郭子豪、马凌迪、吴颖、李雪雪，牛静、褚巧云、付艳霞老师，首都医科大学附属佑安医院/北京肝病研究所博士后阳荣辉也为本研究做出了重要贡献。