Nature子刊：陈斯迪团队开发多种Cas12a 敲入小鼠模型，用于多重基因组编辑、疾病建模和免疫细胞工程

耶鲁大学陈斯迪课题组在 Nature Biomedical Engineering 期刊发表了题为：Cas12a knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune cell engineering 的研究论文。

该研究开发出多种 Cas12a 敲入小鼠模型，助力针对复杂基因互作网络，疾病建模与免疫遗传学的研究。

在这项最新研究中，陈斯迪教授团队开发了一系列背景为 C57BL/6 的 Cre 依赖的条件性表达小鼠或组成性表达 Cas12a 小鼠模型，包括 LbCas12a 和高保真增强版 AsCas12a（enAsCas12a-HF1）。

研究团队首先通过与 CMV-Cre 小鼠交配获得了组成性表达 Cas12a 蛋白的小鼠，验证了 Cas12a 蛋白的表达及在不同主要器官中的表达量，并通过全鼠表型分析证实 Cas12a 的组成性表达并未导致与 C57BL/6 背景品系相比的任何可辨别的病理差异。通过使用 LbCas12a 和 enAsCas12a 小鼠原代免疫细胞，他们在 T 细胞和骨髓来源的树突状细胞（BMDC）中实现了高效的双基因编辑（Double Knockout）。高通量测序结果显示，使用 enAsCas12a 小鼠系统可以在这些细胞类型中实现高达 90% 的基因编辑效率。

为了验证 Cas12a 敲入小鼠在体内基因编辑中的应用，研究团队使用 LNP 系统将靶向 Ttr 基因的CRISPR RNA（crRNA）递送到组成性表达 enAsCas12a 的小鼠体内。实验结果显示，注射后 6 天，血清中 TTR 蛋白水平显著下降，并在 20 天内保持稳定。这表明，LNP-crRNA 系统在体内具有高效的基因靶向能力。

为了进一步验证 Cas12a 敲入小鼠优越的的体内基因编辑效率及在癌症建模中的应用，研究团队设计了一个包含四个肿瘤抑制基因（Trp53、Pten、Apc和Rb1）的 AAV-crTSG 表达阵列，并通过 AAV 系统递送到条件性表达 enAsCas12a 小鼠体内。结果显示，注射后一个月内，所有注射 AAV-crTSG 的小鼠均在头颈部位形成了侵袭性肿瘤，而对照组小鼠（注射AAV-vector）未观察到肿瘤形成。组织学分析显示，这些肿瘤具有典型的鳞状细胞癌特征，并且肿瘤细胞中表达 enAsCas12a-HF1-GFP 蛋白，表明肿瘤的形成是由 AAV-crTSG 介导的基因编辑引起的。

为了实现同步基因激活和敲除，研究团队将 LSL-enAsCas12a-HF1 小鼠与 dCas9-SPH 转基因小鼠交配，生成了 LSL-enAsCas12a-HF1；dCas9-SPH 双转基因小鼠。双转基因老鼠及配合设计的一个包含 Cas9-sgRNA 和 Cas12a-crRNA 的融合引导 RNA 系统，研究团队建立了一个同时进行双基因激活和敲除（DAKO）的系统。DAKO 系统的有效性在 BMDC 细胞实验中得到验证，流式分析实验结果显示，DAKO 系统在单个细胞水平上同时实现双基因激活和敲除，为研究复杂基因相互作用网络提供了强大的工具。

Cas12a 敲入小鼠的开发为多重基因编辑、疾病建模和免疫遗传学研究提供了一个强大的平台。这些小鼠品系及其伴随的病毒和非病毒递送载体，共同构成了一个广泛适用的工具包，能够应用于基因编辑、免疫细胞工程、免疫学发现和复杂基因相互作用的解卷积。随着递送载体的优化及靶点组合的精确设计，Cas12a 敲入小鼠有望在临床治疗中发挥重要作用，不仅应用于肿瘤治疗，还可扩展至其他疾病领域，为精准个性化治疗和通用治疗铺平道路。

该研究由耶鲁大学陈斯迪教授课题组主导完成，耶鲁大学博士学生唐开元和周立群为该论文的共同第一作者。陈斯迪教授、约翰·霍普金斯医学院 Matthew Dong，以及即将成为威斯塔研究所（The Wistar Institute）独立PI的周小宇博士为该论文的共同通讯作者。