《自然·生物技术》：太震撼了！革命性三维可视化成像技术诞生，或改变我们对健康状态和疾病过程的认知

Ali Ertürk团队三年前带给我的视觉震撼，至今仍记忆犹新。

2019年12月，来自德国慕尼黑亥姆霍兹中心的Ertürk团队，以封面文章的形式在顶级期刊《细胞》发表重磅研究成果[1]。

他们在成像技术vDISCO的基础上，开发了一个能处理3D影像的DeepMACT的人工智能算法。基于DeepMACT，他们首次让由单个癌细胞形成的转移灶变得可视化。

肺部的癌症转移灶（红色的是小肿瘤）

今天，Ertürk团队再次取得突破，在顶级期刊《自然·生物技术》上发表重要成果，宣布开发了一种新的全身免疫标记成像技术wildDISCO[2]。

与之前的同类可视化成像技术相比，wildDISCO的标记依赖于广泛使用的IgG抗体，无需造价昂贵且耗时的转基因技术或纳米抗体技术，成功克服了现有方法面临的技术限制。

基于这项新技术，他们以细胞级别的分辨率，绘制了小鼠外周神经系统、淋巴管和免疫细胞图谱。此外，他们还基于wildDISCO发现微生物的缺失会损害神经系统的发育，以及探索了三级淋巴结构和乳腺癌转移之间的关系。

Ertürk团队认为，这项革命性技术呈现的详细三维结构图，为我们理解复杂的生物系统和疾病提供了新的线索，有可能改变我们对健康状态和疾病过程的理解。

论文首页截图

解剖学的发展，让我们对人体和模式动物的组织和器官有了详细的了解。

然而，如果你想了解全身细胞的分布、连接等信息，目前仍面临很多挑战。在过去二十年里，虽然科学在使整个小鼠和人体器官光学透明化方面取得了巨大进步，但他们在标记要研究的结构和细胞方面仍面临很多问题。

小鼠的透明化处理，也是wildDISCO关键的一步

当前，标记成像主要依赖于荧光蛋白的转基因表达，以及纳米抗体的使用。不过，这两种方法成本高昂，且需要耗费很长时间。Ertürk团队这次的目标是，让种类繁多且使用广泛的IgG抗体成为标记抗体，一方面可以扩大全身成像技术的使用范围，另一方面可以降低时间和金钱成本。

摆在Ertürk团队面的问题是，如何让巨大的IgG抗体均匀渗透到不同的组织或细胞之中。这个问题是IgG抗体成为标记物的最大绊脚石。

他们推测，可能是透明化的过程中细胞膜胆固醇提取不够充分阻碍了组织的通透性。因此，他们使用一种环糊精（CD5）进一步去除细胞膜中的胆固醇。没想到真是胆固醇在捣鬼，在用CD5去除胆固醇之后，抗体可以均匀渗透进小鼠的组织中，且不会出现聚集的现象。他们将这种改进的方法称为wildDISCO。

随后，他们将wildDISCO与其他几种成熟的方法（vDISCO、iDISCO、uDISCO和PEGASOS）做了比较。发现，在使用标准抗体时，四种成熟方法成像都是模糊的，只有wildDISCO的成像清晰可见。

五种成像方法的比较

此外，他们还将wildDISCO与基于转基因的方法做了比较，发现与wildDISCO相比，转基因的方法不能准确地反映内源蛋白的真实分布情况。这进一步体现了wildDISCO方法的优越性。

技术改进完之后，就是考验wildDISCO成像效果的时候了。

Ertürk团队首先给小鼠全身的外周神经系统进行了成像。

小鼠全身神经和特定组织器官的神经

从上图可以看出，小鼠全身不同深度的外周神经系统都被均匀染色，而且不同组织的信号强度没有明显差异。心脏、脾脏、肝脏、胆囊等处的神经均清晰可见，还可以观察到不同器官之间的神经连接。

随后，他们又绘制了小鼠全身的淋巴系统图，并详细观察了肝脏、肾脏、气管、胃和肠道的淋巴管。有意思的是，虽然通常认为脑实质中没有淋巴管，但是他们却观察到小而短的淋巴毛细管从脑膜进入脑实质，还观察到一些淋巴管连接嗅球和皮层，以及丘脑周围脑实质中也有淋巴管。

为了探索wildDISCO是不是可以同时标注两个不同的系统，Ertürk团队对神经和免疫细胞做了共免疫标记。成像结果显示，免疫细胞沿着交感神经系统的部分区域聚集，尤其是在肠系膜下丛，而且免疫细胞和肠壁上的交感神经存在频繁接触。

神经系统和免疫的共成像

在研究的最后，Ertürk团队尝试性探索了两个临床问题。

第一个临床问题是微生物对小鼠神经发育的影响。

科学家已经知道，微生物群在神经系统的发育和功能执行中发挥着重要作用。因此，无菌小鼠的行为常常会发生改变，例如出现焦虑样行为增加和社交行为受损等问题。不过，目前还没有系统地研究微生物的缺失对全身神经发育的影响。

Ertürk团队比较了无菌小鼠和野生型小鼠的神经系统差异，结果发现，与4周龄的野生型小鼠相比，4周龄的无菌小鼠肠壁的神经晶格网络密度大大降低。到3月龄时，无菌小鼠的晶格网络密度更低，且轴突退化更严重。不难看出，微生物对小鼠神经的发育至关重要。

微生物对神经系统发育的影响

第二个临床问题涉及免疫治疗，是三级淋巴结构（TLS）与癌症转移之间的关系。

近年来，因为有研究发现三级淋巴结构与免疫治疗效果之间存在关系，所以三级淋巴结构也是目前的研究热点。不过，三级淋巴结构在全身的分布与原发肿瘤和转移瘤之间的关系尚不清楚。

Ertürk团队以乳腺癌细胞系（4T1）为研究对象，先观察了乳腺癌转移灶的情况，发现微转移灶遍及小鼠全身，80%以上的转移灶体积在0.02mm³以内，主要分布在肺部（62%）和肠道（19%）。

接下来，他们探索了转移灶和三级淋巴结构之间的关系。研究结果表明，三级淋巴结构主要位于肺和肠道转移灶附近，其密度与转移灶密度呈正相关。与转移灶相比，三级淋巴结构的体积明显较小，即使是体积较大的三级淋巴结构（平均体积为0.0021mm³）也比转移灶（平均体积为0.066mm³）小约30倍。

此外，他们还发现，大多数三级淋巴结构与其他三级淋巴结构之间的最小距离平均约为0.4mm；转移灶与其最近的三级淋巴结构之间的平均距离约为1571μm；距离三级淋巴结构较近的转移灶平均体积为0.023mm³，小于全身转移灶的平均体积。

转移灶和三级淋巴结构

以上这些数据，具化了我们对三级淋巴结构和转移灶之间相互作用的理解，基于此开展进一步的研究，或许有助于免疫治疗取得新突破。

总的来说，Ertürk团队开发的wildDISCO成像技术，突破了同类方法面临的技术限制，让使用广泛的IgG类抗体成为有效标记物，极大地拓宽了此类成像技术的适用范围。

参考文献：

[1].Pan C, Schoppe O, Parra-Damas A, et al. Deep Learning Reveals Cancer Metastasis and Therapeutic Antibody Targeting in the Entire Body. Cell. 2019;179(7):1661-1676.e19. doi:10.1016/j.cell.2019.11.013

[2].Mai, H., Luo, J., Hoeher, L. et al. Whole-body cellular mapping in mouse using standard IgG antibodies. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01846-0