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研究揭示CRISPR-Cas12a蛋白复合体切割双链DNA的动态调控机制

来源:清华大学 2019-08-10 15:11


2019年8月6日,清华大学生命科学学院陈春来研究组在Cell期刊新推出的子刊《iScience》上发表了题为“crRNA和DNA的匹配度对Cas12a蛋白复合体切割双链DNA的动态结构和切割位点的调控”(Conformational dynamics and cleavage sites of Cas12a are modulated by complementarity between crRNA and DNA)的研究论文。该论文利用单分子荧光共振能量转移技术(single-molecule FRET)直接观测Cas12a复合体切割过程中动态构象变化,建立了相应的定量动力学模型,并揭示了crRNA和DNA的匹配度对复合体动态结构和切割位点调节机制。

Cas12a蛋白(又称Cpf1)在哺乳动物的基因编辑中展现出了比Cas9蛋白更高的切割特异性。因此Cas12a切割双链DNA的分子机制受到了研究者的广泛关注。该研究利用单分子荧光共振能量转移技术,通过标记在crRNA和DNA上的荧光FRET对,来直接观测LbCas12a复合体在切割双链DNA过程中的动态构象变化,最终构建的定量动力学模型如图。首先,Cas12a/crRNA二元复合物识别靶标DNA序列,形成三元复合物,并在PAM序列近端开始形成R-loop(low FRET态)。随着R-loop的进一步延伸,Cas12a蛋白的核酸酶活性被激活,并且使得非互补链(NTS)从双链DNA结构解开,将切割位点暴露出来,以完成NTS链的切割(medium FRET态)。断裂的NTS链稳定了Cas12a复合体的互补链(TS)切割构象(high FRET态),以完成对TS链的切割。

通过以上模型,该研究揭示了Cas12a切割双链DNA过程中的重要分子机制。1)Cas12a结合和切割DNA过程中高度可逆的动态过程是导致其高特异性的重要因素之一;2)非互补链(NTS)从双链DNA上解开以暴露其切割位点这一过程,晚于Cas12a核酸酶活性的激活过程,是切割中重要的校验步骤;3)只有断裂的NTS链,才能稳定Cas12a复合体的互补链(TS)切割构象,从而确保了Cas12a利用单个结构域对两条DNA链有序的切割过程;4)Cas12a复合体存在多个互补链(TS)切割构象,可切割产生不同长度的产物,而切割构象的相对稳定性受到crRNA和DNA的匹配度的调控。(生物谷Bioon.com)
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