Nat Chem Biol | 华东理工大学杨弋/陈显军等合作开发新的荧光RNA适配体

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)是生物化学和细胞生物学中研究最广泛、应用最广泛的荧光蛋白之一。由于GFP具有固有的荧光特性，成熟快速且完全，对融合蛋白具有良好的耐受性，并且在常规荧光仪器上使用标准滤光片可以方便地可视化，因此GFP不仅在研究蛋白质动力学和功能方面具有很大的用途，而且在活细胞和活体中检测离子、代谢物信使和蛋白质相互作用。最近，荧光RNA (FRs)，由RNA适体及其荧光配体组成的荧光蛋白样实体，已成为标记RNA并研究其复杂时空动态和生物学功能的一种有前途的方法。同样，绿色荧光蛋白与标准的绿色荧光蛋白滤光片的光谱拟合对于细胞RNA的单色或多色成像特别有用。

以前，已经开发了几种基于花青素衍生的荧光基团或荧光基团-猝灭剂共轭物的绿色荧光基团。然而，这些绿色FRs中的很大一部分不适合用于活细胞成像，因为它们识别的染料几乎不具有细胞渗透性和/或具有明显的背景荧光。类似GFP的荧光团包括DFHBI、HBC530及其衍生物，它们具有高的细胞通透性和大大降低的背景荧光，也被用于开发绿色FRs。这些绿色FRs允许成像和跟踪活细胞中的几种信使RNA(mRNAs)和非编码RNAs，而背景很少，然而，它们的广泛应用已经受到诸如快速光漂白，细胞亮度不足以及对细胞镁水平的依赖等限制的阻碍。

ACE结构、SELEX程序及预测Okra二级结构（Credit: Nature Chemical Biology）

此外，DFHBI衍生的荧光团可以被菠菜、西兰花和南瓜识别和激活，并且TO1-B可以与芒果或菠菜形成配合物，使得这些FRs缺乏双正交性，可能是因为它们在结构上共享G-四联体。尽管已经进行了大量的RNA和荧光团优化，旨在提高这些绿色FRs的亮度和光稳定性，但它们的细胞亮度和光稳定性仍然不足。之前设计了一种类似GFP的合成染料(4-(2-羟乙基)(甲基)氨基)-苄基)-氰苯乙腈(HBC530)，并开发了一种名为Pepper的荧光RNA适配体，它可以特异性地结合并激活HBC530发出强烈的绿色荧光。Pepper-HBC530复合物的细胞亮度比先前存在的绿色FRs提高了一个数量级，但它的光稳定性有限，并且在激发时经历了快速的光漂白。因此，具有高细胞亮度和光稳定性的鲁棒绿色FRs仍然是非常需要的，但尚未实现。

该研究描述了一种高度明亮和稳定的绿色FR的发展，称为Okra505。Okra与其非GFP类荧光基团配体具有纳米摩尔的高结合亲和力，具有低离子依赖性和高熔融温度的坚固折叠。与其他绿色FRs相比，Okra505在活细胞中发出的绿色荧光增强了一个数量级，从而可以在活细菌和哺乳动物细胞中对mRNA进行稳健的成像。Okra 505还允许时间分辨率测量ACTB mRNA运输到应激颗粒(SGs)，以及与Pepper620结合的活细胞双色超分辨率RNA成像，揭示颗粒中不同RNA的不均匀和不同分布。综上所述，Okra FR填补了活细胞中单色或多色RNA成像中缺乏明亮和稳定的绿色FR的空白。进一步分析Okra的结构不仅有助于人们了解这种RNA-荧光团复合物的光物理性质，而且有助于未来开发出具有高亮度和光稳定性的新型荧光材料。