Nature： “误会”致癌基因？研究揭示髓母细胞瘤起源新图景，CNVs才是幕后“启动者”！

谁是“始作俑者”？CNVs：肿瘤发生的早期足迹

研究的核心发现之一是：大范围的染色体拷贝数变异（CNVs）才是髓母细胞瘤发生的早期启动事件（early tumour-initiating events）。通过对单细胞CNV图谱进行分析，研究人员发现，在大多数病例中，肿瘤的推定创始克隆（presumptive founder clone, CO）就已经携带了这些大范围的CNVs，例如8号和10号染色体的丢失，或者7号和17q染色体的获得。而那些局灶性的、单个基因的致癌事件，如MYCN扩增，则是在此之后才出现的。

为了进一步验证这一点，研究人员利用群体遗传学模型（population genetics model），结合从大量髓母细胞瘤（包括来自ICGC数据库的108例3/4组病例）全基因组测序（WGS）数据中测得的体细胞单核苷酸变异（somatic single-nucleotide variants, SNVs）密度，对肿瘤的发生时间进行了追溯。SNVs像一个分子时钟一样，随着细胞分裂持续积累。研究发现，在181例原发髓母细胞瘤中，婴儿SHH亚型（infant Sonic Hedgehog, SHH）的SNV密度最低（平均每Mb 0.02 ± 0.01个SNVs），其次是3/4组（平均每Mb 0.1 ± 0.08个），WNT组（平均每Mb 0.28 ± 0.47个），最后是成人SHH亚型（平均每Mb 0.41 ± 0.46个）。这与疾病的发病年龄分布高度相关（Spearman相关性达到0.73）。

更重要的是，研究通过比较肿瘤的最近共同祖先（most recent common ancestor, MRCA）和早期共同祖先（early common ancestor, ECA）的SNV密度，发现有证据表明，在109例3/4组髓母细胞瘤中的34例病例中，至少一个拷贝数获得（CNV gain）发生在肿瘤的ECA阶段，即比肿瘤MRCA更早。这些发生在ECA的早期CNVs数量从1到16不等，平均有5.3个。

基于这些数据和模型，研究人员估计，髓母细胞瘤的启动（ initiation）可能早在胎儿发育的第一个妊娠期（first gestational trimester）就开始了（在24%的病例中），在妊娠后期（around 35%）和出生后第一年（26%）也有发生。而肿瘤的快速增长（onset of tumour growth），则通常发生在出生后的头十年内，比肿瘤的启动晚得多。这暗示在预恶性（pre-malignancy）阶段和有症状的肿瘤出现之间，可能存在一个漫长的潜伏期（latency phase）。

这些发现支持了CNVs是髓母细胞瘤早期启动事件的观点，它们在胎儿发育的关键时期，在小脑单极刷状细胞祖细胞（cerebellar unipolar brush cell, UBC）这一推定细胞起源类型中就已经出现，奠定了肿瘤发生的基础。

延迟爆发？致癌基因的“潜伏期”

与CNVs的早期出现形成鲜明对比的是，MYC、MYCN扩增和PRDM6过表达这些单基因致癌事件，通常是晚期发生的，并且在肿瘤内是以亚克隆（subclonal）的形式存在。在研究分析的MYCN扩增肿瘤样本中（共4例），MYCN扩增在所有病例中都是亚克隆的，而非在创始克隆中。MYC扩增在检测到的7例MYC扩增样本中的6例中也都是亚克隆的。PRDM6过表达在检测到的5例高表达PRDM6样本中的3例中是亚克隆的。

这意味着，在肿瘤启动并积累了早期CNVs之后，这些局灶性的致癌基因异常才作为后续事件（subsequent events）在肿瘤演进过程中出现，并通常只影响肿瘤细胞群体中的一部分，形成亚克隆。

一个有趣的观察是，那些已知存在MYC、MYCN或PRDM6这些晚期驱动基因异常的3/4组髓母细胞瘤，其在ECA和MRCA阶段的SNV密度均显著高于没有这些晚期驱动基因异常的肿瘤（在ECA阶段，有驱动基因肿瘤的SNV密度P=0.026；在MRCA阶段，有驱动基因肿瘤的SNV密度P=0.031）。这可能暗示，较晚的预恶性肿瘤发生时间窗口，可能更容易获得这些后续的致癌驱动基因。

因此，与CNVs扮演的“启动者”角色不同，MYC、MYCN和PRDM6等致癌基因更像是肿瘤发生进程的驱动者（drive progression），它们在肿瘤已经建立后出现，加速了肿瘤的生长和发展。

“单打独斗”还是“鸡犬相闻”？肿瘤微观世界的空间格局

肿瘤内的不同亚克隆细胞群体并非均匀分布，它们在物理空间中的位置关系对于理解肿瘤内的相互作用至关重要。研究利用空间转录组学技术，观察了肿瘤亚克隆的空间分布模式。

研究人员发现了两种主要的空间分布模式：一种是亚克隆交织分布（interspersed spatial pattern），不同的亚克隆细胞群体混合在一起，遍布整个肿瘤组织；另一种是亚克隆分隔分布（segregated spatial separation），不同的亚克隆形成清晰的边界，占据肿瘤组织中的不同区域。

在MYCN扩增的肿瘤中，MYCN扩增和非MYCN扩增的亚克隆大多呈现交织分布的模式，形成夹杂在一起的“口袋”状区域。MYC扩增的肿瘤也主要表现为亚克隆交织分布，但也可以观察到一些非MYC扩增亚克隆的分隔分布“岛屿”。而PRDM6过表达的肿瘤则显示出更明显的亚克隆分隔分布。

有趣的是，尽管肿瘤亚克隆的空间分布不同，但肿瘤内处于增殖状态（proliferating）的细胞，无论属于哪个亚克隆，往往都是交织分布在肿瘤组织中的，并未形成显著的物理分隔。这意味着不同亚克隆中的增殖细胞可能彼此相邻，促进了细胞间的交流和相互作用。

这种复杂的空间格局可能影响肿瘤内不同亚克隆之间的竞争或合作，共同驱动肿瘤的演进。亚克隆的物理位置可能会影响它们获取资源的能力、对微环境信号的响应以及与免疫细胞的互动，从而影响肿瘤的整体行为。

亚克隆的“内卷”：MYC在复发中的“上位史”

研究发现的一个特别案例是，在同一例原发肿瘤样本MB272中，同时检测到了MYC扩增（亚克隆C3）和MYCN扩增（亚克隆C2）。虽然MYC和MYCN通常被认为是相互排斥的致癌基因（在包含435例髓母细胞瘤FFPE样本的Bulk RNA-seq队列中，MYC和MYCN的表达呈负相关，R = -0.287, P = 1.08e-09），但这项研究及其他独立案例表明，它们确实可能在同一肿瘤内共存，只是存在于不同的细胞群体中，并且这些亚克隆在空间上是清晰分隔的。

更引人注目的是对复发病例的分析。研究对4例复发的MYC扩增髓母细胞瘤进行了单细胞分析，发现在所有这些复发样本中，MYC扩增存在于所有（clonal）肿瘤细胞中。尤其是在前面提到的MB272样本的配对复发样本中，原发肿瘤中的MYCN亚克隆在复发时已经消失了，而MYC亚克隆成为了主要的肿瘤群体。

这一发现强有力地表明，在肿瘤进展或复发过程中，MYC亚克隆可能比其他亚克隆更具竞争优势（outcompetes），从而扩张成为肿瘤的主要甚至唯一的组成部分。这提示我们，即使在诊断时肿瘤只存在少量（低丰度）的亚克隆MYC扩增，它也有潜力在后期“逆袭”并驱动疾病进展和治疗抵抗。因此，在诊断时检测到亚克隆的MYC扩增，可能成为预测复发风险的重要指标。

推翻旧论？对肿瘤起源和进化的新认识

这项研究的结果对髓母细胞瘤的起源和进化模型提出了新的见解，挑战了一些传统的观点。

首先，研究认为大范围CNVs而非单基因致癌事件是髓母细胞瘤的启动者（initiating events）。这些CNVs在胎儿发育的早期阶段（第一个妊娠期）就已经发生，奠定了肿瘤发生的遗传基础。

其次，MYC、MYCN和PRDM6等致癌基因并非疾病的启动者（initiators），而是驱动者（drivers）。它们在肿瘤启动后，通常以亚克隆形式出现，加速肿瘤的生长和进展，并在治疗抵抗和复发中扮演关键角色。

这一模型也对“肿瘤干细胞”理论提出了补充或挑战。研究发现，髓母细胞瘤保留了具有不同增殖和分化能力的 distinct subclones（不同的亚克隆），无论是否存在已知的致癌基因异常。这些亚克隆可能并非严格遵循层级结构的“干细胞”模式，而是形成更复杂的动态平衡。

最后，通过分子时钟和模型推演，研究勾勒出髓母细胞瘤多步骤发生的图景：早期（胎儿期）的CNVs导致预恶性克隆的出现，之后经过数年的漫长潜伏期，在儿童早期出现后续驱动基因异常，最终形成临床可见的肿瘤。这与另一种儿童肿瘤——神经母细胞瘤（neuroblastoma）的发现有相似之处，神经母细胞瘤也被发现是CNVs在第一个妊娠期启动的。

黎明的曙光？对早期诊断和治疗的启示

这项研究不仅深化了我们对髓母细胞瘤生物学机制的理解，也为未来的诊断和治疗提供了新的思路。

更精准的诊断： 单细胞和空间组学技术的应用，使我们能够识别和分析肿瘤内部的亚克隆组成和空间分布。这可能比传统的批量检测（bulk analysis）更能揭示肿瘤的真实复杂性，尤其对于那些在批量检测中可能因丰度低而被忽视的亚克隆（如低丰度的亚克隆MYC扩增）。研究发现，在亚组V中，仅凭批量CNV分析识别出的4例MYC扩增患者预后较差，而通过去卷积分析（deconvolution analysis）识别出的14例可能存在MYC亚克隆的患者也显示出更低的总体生存率（overall survival）。这提示单细胞分析可能成为未来诊断和风险分层的重要工具。

预测复发风险： 研究发现，亚克隆MYC扩增在复发时可能占据主导地位。这意味着如果在初次诊断时就能检测到低丰度的亚克隆MYC扩增，即使它不是主要的肿瘤细胞群体，也可能预示着较高的复发风险。这需要未来的研究进一步验证，但也为利用单细胞技术进行复发预测提供了新的方向。

挑战现有诊疗标准： 目前基于FISH等技术对MYC/MYCN扩增设定的诊断阈值，可能无法捕捉到所有具有潜在扩张能力的MYC亚克隆。研究结果提示，即使是最小的MYC亚克隆，也可能驱动疾病进展。

探索早期干预可能性： 了解肿瘤在胎儿发育阶段就已经由CNVs启动，并存在一个长期的预恶性潜伏期，这或许为未来的早期检测和干预提供了理论基础。虽然目前仍处于早期阶段，但能否利用对这些早期CNVs的认识，开发出在肿瘤变得有症状之前就进行干预的方法，是值得探索的重要方向。

当然，这项研究也存在局限性，例如空间转录组学技术在基因数量和图像尺寸上的限制。但随着新技术的不断发展，我们有望更全面地描绘肿瘤的微环境和亚克隆动态。

总之，这项研究通过揭示髓母细胞瘤复杂的亚克隆结构、早期由CNVs启动的发生机制以及MYC等致癌基因在后期驱动进展的角色，极大地推动了我们对这种儿童恶性肿瘤的理解。未来的工作将继续深入探索如何将这些前沿发现转化为更有效的早期诊断工具和个性化治疗策略，最终改善患儿的预后。这不仅仅是基础科学的突破，也承载着为无数家庭带来希望的重任。