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Cell论文详解:通过植物免疫蛋白挽救miRNA缺陷,实现广谱抗肿瘤反应

来源:生物世界 2022-06-21 13:37

该研究阐明了植物免疫蛋白 RDR1 抑制癌细胞细胞周期的机理,为开发新的癌症治疗方案提供了潜在的研究方向。
癌症泛指所有的恶性肿瘤,是一类细胞异常增殖的疾病,全球大约六分之一的死亡由癌症造成。近年来,miRNA 被认为是影响癌症发生的重要 RNA 分子,miRNA 参与各种生理活动,许多 miRNA 可以直接靶向并抑制细胞周期基因,从而直接控制细胞增殖。有研究表明,miRNA 剂量减少是诱发癌症的主要原因之一[3],但其减少的原因尚不清楚。因此,能否通过修复肿瘤中 miRNA 剂量减少引起的缺陷通路从而实现对于肿瘤细胞增殖的抑制,是目前研究的关键点。
北京大学杜鹏团队在国际顶尖学术期刊 Cell 上在线发表了题为:A plant immune protein enables broad antitumor response by rescuing microRNA deficiency 的研究论文。
该研究发现,不同的人类原发性癌症样本和癌症细胞系中广泛积累着不能有效结合 AGO2 复合体的3'末端短 1-nt 的 miRNA 异构体植物免疫蛋白 RDR1 可以修饰这些 AGO2 游离出的 miRNA 双链异构体,进而重新激活有缺陷的 miRNA 通路,以此来特异性阻断实体瘤和白血病中癌细胞的细胞周期。其模式图如下:
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图1:植物RDR1修复缺陷miRNA实现抗肿瘤作用模式图(图片来自原文)

在本研究工作中,作者主要有以下发现:

1、RDR1蛋白通过靶向细胞周期广泛抑制癌细胞的增殖

为了在哺乳动物细胞中进行基于植物RDR1的生物工程,作者分别从拟南芥(At)和水稻(Os)中克隆RDR1基因到基于Dox诱导的慢病毒载体上。最终,本研究获得了13个稳定的RDR1诱导细胞系(包括7个实体瘤、3个白血病、3个非癌症细胞系)和2个RDR1恒定表达的胚胎干细胞系。通过Western blot和活细胞成像,作者验证了RDR1在哺乳动物细胞中成功实现了异位表达。

在接下来的研究中,令作者惊讶和意外的是,AtRDR1和OsRDR1能够在体外显著抑制所有10种癌症细胞系的增殖,但对其他5种非癌细胞没有影响。RDR1还可以显著抑制癌细胞的克隆形成能力。在分子水平上,基于RNA-seq的基因集富集分析(GSEA)表明,AtRDR1和OsRDR1可以干扰所有癌症细胞系中的细胞周期过程,但在非癌对照细胞中没有明显作用。值得注意的是,短时间(2-3天)诱导RDR1同样可显著抑制癌细胞中的细胞周期过程,表明细胞周期通路可能是RDR1的直接作用靶点。随后,EdU/PI染色分析显示,RDR1在癌细胞中的表达显著降低了S期的细胞比例,反而增加了G0/G1期的细胞比例。因此,作者认为植物免疫蛋白RDR1是一种外源肿瘤抑制因子,它能够特异靶向并干扰癌细胞中的细胞周期过程,但在非癌症细胞中却不起作用。

 

2、在3’末端短1个碱基的受损的miRNA异构体在多种肿瘤中广泛积累

由于RDR1参与植物中的小RNA通路,作者在RDR1诱导表达前后的癌症和非癌症细胞中进行小RNA 测序。令人惊讶的是,作者发现诱导RDR1后的癌症细胞中miRNA的整体表达明显增加,但在非癌症细胞系中却没有出现这种现象。随后,作者还通过miRNA通路关键组分的敲低和AGO2-CLIP等实验,提出植物RDR1通过提高全局miRNA表达以特异挽救癌细胞中的miRNA缺乏来抑制细胞周期和增殖。

为了进一步研究RDR1特异靶向癌细胞的机制,作者对已公开发表的小RNA测序数据进行系统分析,包括TCGA数据库的9980组癌症病人数据以及GEO数据库的癌症病人、癌症细胞系以及正常组织的数据。结果表明,在很多癌症病人和细胞系的样本中,在3’末端短1-nt的miRNA异构体出现了大量的积累。这些3’末端短1-nt的miRNA在部分癌症样本中甚至成为不同miRNA异构体中数量最多的群体。由于AGO蛋白结构的特殊性,2-nt悬垂的结构有利于miRNA双链进入AGO2中形成RISC 。作者提出,这种1-nt悬垂的异构体,相比于2-nt悬垂的异构体进入AGO2的效率更低,并通过EMSA和MST实验进行了验证。同时,通过AGO2-IP的小RNA测序,作者进一步分析发现3’末端短1-nt的miRNA异构体在Input组更富集,进一步表现出短1-nt的miRNA异构体进入AGO2的效率更低。综上,作者提出,在癌细胞中,这种短1-nt的异常miRNA双链异构体不能有效地进入到AGO2中,并且不稳定,因此可能与不同肿瘤中的miRNA剂量减少有关。

 

3、RDR1通过单核苷酸加尾修复癌症中有问题的miRNA异构体

据报道,植物RDR6同时具有RNA聚合酶和核苷酸转移酶活性,而在后续的小RNA测序数据分析中,作者发现具有3’端单核苷酸加尾的成熟miRNA特异富集于RDR1异位表达的癌症细胞中。有趣的是,这种单核苷酸加尾主要出现在3’末端短1-nt的miRNA上,但很少出现在注释的切割末端上。随后作者在大肠杆菌中纯化出重组的rAtRDR1和酶活位点突变的3DA mutant rAtRDR1。通过体外生化实验,作者直接证明了rAtRDR1能够对单链miRNA和具有1-nt或2-nt悬垂的miRNA双链进行3’末端单核苷酸修饰,但不能修饰具有平末端的miRNA双链。

结合以上的发现,作者设想RDR1倾向于识别AGO2中游离出来的具有1-nt悬垂的miRNA双链作为底物,这些异构体尤其在癌症细胞中积累,但在非癌症细胞中不积累,并用单核苷酸加尾修饰这些有问题的miRNA。为了验证这一点,作者首先在表达RDR1的肺癌A549细胞中进行了AGO2敲低实验,随后进行小RNA序列分析。正如预期的那样, AGO2缺失确实进一步加强了RDR1介导的miRNA修饰,在癌细胞中短1-nt的miRNA异构体上单核苷酸加尾的比例大幅提高。之后,体外将rAGO2与具有1-nt/2-nt悬垂的miRNA双链预孵育后再加入rRDR1进行游离miRNA双链的加尾实验,结果显示与AGO2亲和力较低的1-nt悬垂的miRNA双链在与rAGO2蛋白预孵育后更倾向于被RDR1修饰。

最后,作者还通过给1-nt悬垂的miRNA双链加尾后的重新结合,1-nt/2-nt外源miR-34c双链的体外转染等实验和分析,共同证明了RDR1拥有核苷酸转移酶活性,能够对AGO2中游离出的短1-nt的miRNA双链异构体进行单核苷酸修饰,以恢复这些异构体对AGO2的装载效率,并最终修复癌症中有缺陷的miRNA通路。

 

4、RDR1抑制多种小鼠实体瘤和白血病的进展

接下来,作者想在小鼠体内验证植物RDR1的抗肿瘤作用。首先,作者将RDR1诱导型癌症细胞系注射免疫缺陷小鼠以进行体内荷瘤实验,并且通过Dox喂水以实现RDR1的异位表达。结果表明,野生型而非突变型RDR1显著抑制了所成肿瘤的大小、体积和重量。作者还发现,在A549,H1299和PC-3细胞所成的荷瘤中,植物RDR1能够显著提高癌细胞中miRNA的表达,从而抑制了癌细胞的细胞周期。

类似的,作者还评估了RDR1在体内白血病小鼠模型中的抗肿瘤作用。与载体对照或突变的RDR1相比,野生型RDR1能够显著抑制三种白血病细胞系(Jurkat、K562和NALM6)在免疫缺陷小鼠外周血中的增殖,并最终延长异种移植小鼠的寿命。同样,RDR1可以在体内显著增加白血病细胞中的miRNA表达以抑制白血病细胞中的关键细胞周期组分,包括CDK1、CCNE2、PLK1、CDK6等,从而抑制细胞周期。

最后,通过纳米囊泡包装体外纯化的RDR1蛋白和AAV包装的RDR1,分别在体外细胞和体内实体瘤水平上实现了RDR1的直接递送和肿瘤抑制。

该研究阐明了植物免疫蛋白 RDR1 抑制癌细胞细胞周期的机理,为开发新的癌症治疗方案提供了潜在的研究方向

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