Nat Biotechnol：周英思/杨辉/谭国鹤/黄锦海等合作:smCRISPRa——基于紧凑型Cas12m的单AAV体内多重基因激活平台

实现体内协调的基于CRISPR的转录激活（CRISPRa）调控仍然具有挑战性，因为所需遗传元件经常超过AAV载体的包装容量。

2026年10月28日，中国科学院上海药物研究所和中山药物创新研究院杨辉/周英思/李国玲团队、广西医科大学谭国鹤团队以及复旦大学附属眼耳鼻喉科医院黄锦海团队等多家国内单位合作在Nature Biotechnology在线发表题为“An engineered, compact Cas12m variant for multiplexed gene activation in vivo”的研究论文。该研究报告Cas12m蛋白家族的鉴定和工程化，这是一种天然核酸酶死亡的CRISPR系统，对其前体crRNA具有内在自加工活性。作者开发了一种优化变体denCas12m，并将其用于smCRISPRa平台。

编码多gRNA阵列的单个转录单元可在靶细胞内被加工为单独的功能性向导，使得能够通过多个位点高效协同激活单个基因，或从单个一体化AAV载体同时激活不同内源基因。作者证明在杜氏肌营养不良和Scn1a单倍剂量不足小鼠模型中的表型挽救。此外，单个一体化AAV载体支持在小鼠中同时激活多个不同内源基因，单个载体递送多达八个crRNAs以激活六个不同基因，证明该平台的高阶多重化能力。

CRISPR介导的激活（CRISPRa）为单倍剂量不足、部分功能丧失和代偿通路耗竭等疾病提供了一种有前景的治疗策略，在这些疾病中恢复内源基因剂量至关重要。在实践中，单靶点上调通常无法达到足够的转录效力。在许多内源基因座，有效向导位点局限于狭窄的调控窗口，其中严格的原间隔序列邻近基序（PAM）约束和局部不可及的染色质限制了可靶向位置并限制激活因子招募，使表达低于表型挽救所需的功能阈值。因此，多重激活已成为复杂病理（从神经退行性疾病到多基因代谢病）的重要策略。通过同步上调多个基因或一个基因座内不同调控元件，多重化可提高达到治疗相关表达阈值的概率，拓宽响应靶细胞群体并减少对任何单一位点的依赖。然而，在体内部署多重CRISPRa仍然具有挑战性，因为效应因子、调控盒和向导阵列的组合大小经常超过腺相关病毒（AAV）载体的包装容量。强效CRISPR效应因子如Cas12a通常过于庞大而无法单载体包装，而紧凑替代物如Cas12f通常缺乏精简多重向导阵列所需的内在RNA加工活性。这些限制突出表明需要紧凑、高效的CRISPR平台，将多组分激活程序整合到单个可扩展且安全的递送载体中。

V-M型家族为此类应用提供了一个未被充分开发的平台。Cas12m效应因子（约600aa）识别最小的5′-TTN PAM，大幅增加可寻址基因组位点的密度，并在没有tracrRNA的情况下加工pre-crRNA阵列，使得能够对单个基因座或不同基因进行紧凑多重靶向。这些特性非常适合受AAV限制的CRISPRa应用，其中效应因子大小和向导阵列架构决定是否能从单个载体实现多重调控。然而，天然Cas12m蛋白尚未在哺乳动物细胞中开发为CRISPRa效应因子，稳健体内多重基因激活的设计原则仍定义不清。

图1.dCas12m和RNA的工程，以增强转录激活和crRNA的自我加工（摘自Nature Biotechnology ）

在本研究中，作者系统分析了V-M型CRISPR–Cas直系同源物，以鉴定Cas12m18作为一种紧凑Cas12m直系同源物，在作者的报告基因和测序测定中具有最低可检测DNA切割活性，同时在哺乳动物细胞中具有可测量的CRISPRa报告活性和pre-crRNA加工。通过蛋白质和RNA的迭代工程化，作者开发了denCas12m（去活化、增强型Cas12m），一种具有改善激活效率和高特异性的优化效应因子。通过将denCas12m与工程化转录激活因子偶联，作者建立了smCRISPRa（小型多重CRISPR激活），一个用于高效多重激活的紧凑平台。在杜氏肌营养不良（DMD）和Dravet综合征小鼠模型中，smCRISPRa驱动稳健的体内基因上调并实现持久功能挽救和改善疾病表型。此外，编码smCRISPRa的一体化AAV载体能够在体内同时激活多个内源基因，如通过共同靶向Utrn和Fst以减轻营养不良病理以及诱导OSK重编程因子和六个独立基因所示。这些结果确立smCRISPRa作为体内高阶多重基因激活的多功能且可扩展平台。

参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41587-026-03352-5