Nature Methods：ESPRESSO——为单细胞组学注入时空维度，从细胞器景观解码细胞命运

现代生命科学“上帝视角”下的盲区

在我们深入了解 ESPRESSO 之前，不妨先思考一个问题：我们现有的工具究竟缺失了什么？

以单细胞RNA测序 (single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)为例，它无疑是近年来的技术明星。它能让我们分辨出组织中每一个细胞的“身份”，揭示出罕见的细胞亚群，极大地推动了我们对发育、疾病和免疫的理解。然而，scRNA-seq 在分离细胞的那一刻，就无情地抹去了所有空间信息。我们不知道这个细胞原本在组织中的邻居是谁，也不知道它所处的微环境是怎样的。

为了弥补这一缺憾，空间组学 (Spatial omics) 应运而生。它能够在保留空间位置信息的前提下，分析细胞的分子特征。这好比我们不仅有了城市居民的名单，还有了一张标明他们住址的地图。这是一个巨大的进步。

但即便如此，我们依然面对着一个终极的挑战——时间。无论是 scRNA-seq 还是大多数空间组学技术，它们捕获的都是一个时间点。而生命过程，如细胞从一个状态转变为另一个状态，是一个连续的动态过程。我们看到的只是“起点”和“终点”，却错过了中间所有精彩的“剧情”。我们迫切需要一部“摄像机”，而不是一台“照相机”，来完整记录细胞命运的变迁。ESPRESSO，正是为了成为这部能够深入细胞内部的超高清、多维度“摄像机”而诞生的。

ESPRESSO工作流：冲泡细胞“时空大片”的巧妙配方

ESPRESSO 的全称是 Environmental Sensor Phenotyping RElayed by Subcellular Structures and Organelles，意为“由亚细胞结构和细胞器传递的环境感知表型分析技术”。这个名字精准地概括了其核心思想：通过观察细胞器的形态和功能变化，来解读细胞的整体状态。研究人员认为，细胞器是细胞代谢和功能状态最直接、最敏感的“传感器”。它们的形态、数量、位置和功能状态，共同构成了一幅独特的“细胞器图景” (organelle landscape)，这幅图景就是细胞当前状态最真实的写照。

实现这一宏大目标，ESPRESSO 的工作流程巧妙地融合了多种前沿技术，宛如一套精密的组合拳：

第一步：找到“主角”——会“说话”的荧光染料

要观察细胞器，首先要让它们“亮”起来。但 ESPRESSO 选择的不是普通的荧光染料，而是一组对环境敏感的“智能”染料。研究团队精心挑选并优化了四种分别靶向细胞内关键“部门”的活细胞染料：

针对溶酶体 (Lysosomes)的染料，其荧光强度与溶酶体的酸度直接相关，酸性越强，信号就越亮，这反映了细胞的降解和回收能力。对于线粒体 (Mitochondria)，染料的荧光强度依赖于线粒体膜电位，膜电位越高，代表线粒体“能量工厂”的活性越强。此外，还有靶向脂滴 (Lipid droplets)的染料用于标记细胞内的脂肪酸储存，反映能量储备和代谢状态；以及标记细胞核 (Nucleus)中DNA的染料，其分布可以反映染色质的组织和致密程度。

这组染料的巧妙之处在于，它们不仅标记了位置，更能实时报告细胞器的“工作状态”。更重要的是，它们足够稳定，可以在长达24小时的连续成像中保持清晰的信号，同时对细胞的生存和健康影响极小，确保我们观察到的是细胞的真实生理过程，而非人为干扰下的“表演”。

第二步：架设“摄影机”——高光谱成像与AI神助攻

当四种染料同时进入细胞，它们的荧光信号光谱会发生严重重叠，传统的显微镜滤光片系统难以将它们清晰地分离开。这就像在嘈杂的交响乐中试图分辨出每一种乐器的声音。ESPRESSO 采用了高光谱成像 (Hyperspectral imaging) 技术来解决这个问题。这种技术能够在图像的每一个像素点上，采集完整的荧光发射光谱。通过一种名为“相位解混” (phasor unmixing) 的算法，研究人员可以精确地将重叠的光谱信号分离，完美还原每一种细胞器的独立图像。

然而，高光谱成像要获得高质量的图像，通常需要较长的曝光时间，这会增加光毒性，伤害细胞，也无法实现快速的时间分辨率。为了克服这个“速度与质量不可兼得”的矛盾，研究团队引入了人工智能 (AI)。他们使用了一种名为 CARE (Content-Aware Image Restoration) 的卷积神经网络 (CNN)，用成对的高信噪比和低信噪比图像来训练它。训练完成后，这个AI模型能够将采集速度提高16倍的、充满噪声的“草稿”图像，瞬间“修复”成高质量的清晰图像。同时，他们还利用另一个名为 CellPose 的AI模型，精准地自动识别和分割出图像中的每一个单细胞。至此，ESPRESSO 实现了在单细胞水平上，对多种细胞器进行快速、高保真成像的壮举。

第三步：“阅读剧本”——从像素到表型的海量特征提取

获得了清晰的单细胞多色图像后，如何将这些视觉信息转化为可供分析的量化数据呢？这或许是ESPRESSO最核心的创新之一。传统方法可能会满足于计算细胞器的数量、大小或平均亮度，但这些简单的描述符远远无法捕捉细胞器图景的复杂性。

ESPRESSO 采用了一套更为深刻的图像分析方法，主要是图像相关光谱学 (Image Correlation Spectroscopy, ICS) 和图像互相关光谱学 (Image Cross-Correlation Spectroscopy, ICCS)。这些听起来复杂的技术，其本质是分析图像中像素与像素之间的“关系”。研究人员没有满足于应用传统模型去拟合这些相关性函数，而是巧妙地将整个函数本身，每一个数据点，都作为独立的特征。再加上对每个细胞器功能（亮度分布）的深度挖掘，最终，ESPRESSO 从每个细胞中提取了高达 3,328个 定量特征！这是一个极其高维度的描述，它将一个细胞的细胞器图景，转化为了一个由3,328个数字组成的独特“指纹”。

第四步：“剪辑成片”——降维聚类，定义细胞的“剧情线”

面对每个细胞如此庞大的特征数据，研究人员利用一种名为 PaCMAP 的先进降维算法，将这三千多个维度压缩到直观的三维空间中。在这个空间里，拥有相似细胞器“指纹”的细胞会聚集在一起。随后，通过聚类算法，这些细胞群被定义为不同的“ESPRESSO表型” (ESPRESSO phenotypes)。

每一个 ESPRESSO 表型，都代表了一种独特的、由细胞器景观定义的细胞状态。至此，ESPRESSO 完成了从原始图像到抽象细胞状态的完整转化。更重要的是，由于整个过程是基于活细胞成像，我们可以追踪单个细胞在不同 ESPRESSO 表型之间的转换，从而真正地，将细胞的生命活动“剪辑”成一部连贯的、可分析的“时空大片”。

首场试映：ESPRESSO能否分辨“角色”身份？

任何新技术的诞生，都需要经过严格的检验。ESPRESSO 的第一项测试，就是看它能否分辨出不同“身份”的细胞。研究人员选择了四种截然不同的细胞系：非肿瘤性的乳腺上皮细胞 (MCF10A)、三阴性乳腺癌细胞 (MDA-MB-231)、永生化的人类角质形成细胞 (N/TERT-2G) 和小鼠巨噬细胞 (RAW264.7-NOS2)。

结果令人信服。在 ESPRESSO 的分析下，这四种细胞在降维空间中形成了泾渭分明的四个群落，总计8,838个细胞被精准地归类。这证明了 ESPRESSO 能够捕捉到不同细胞类型固有的细胞器景观差异。例如，侵袭性强的乳腺癌细胞 MDA-MB-231，其 ESPRESSO 表型显示出显著更高的染色质致密性；而 MCF10A 细胞则以其高线粒体膜电位为特征。这些发现不仅验证了技术的可靠性，也与已知的生物学知识相符，为后续更复杂的应用奠定了坚实的基础。

剧情深入：细胞压力之下的“表情”指纹

细胞在面对外界环境压力时，会迅速调整自身状态以求生存。这种应激反应是生命的基本特征。ESPRESSO 能否捕捉到细胞在压力下的细微“表情”变化，甚至区分不同压力的“类型”？

为了回答这个问题，研究人员用六种不同的化学物质处理 MCF10A 细胞，每种物质都会诱导一种特定的细胞应激：氯化钴 (CoCl₂) 模拟缺氧环境，辛伐他汀 (Simvastatin) 抑制胆固醇合成，巴弗洛霉素A1 (Bafilomycin A1) 抑制自噬过程，FCCP 破坏线粒体功能，漆树酸 (Anacardic acid) 压缩染色质，以及曲古抑菌素A (Trichostatin A) 使染色质解压缩。

24小时后，ESPRESSO 对这些细胞进行了“体检”。结果非常精彩。不同的应激处理，在 ESPRESSO 的表型图谱上留下了独一无二的“指纹”。例如，模拟缺氧的 CoCl₂ 处理，导致细胞倾向于一种高脂肪酸储存的表型，这与细胞在缺氧时转向储存能量的已知反应完全一致。而辛伐他汀则诱导细胞产生更高的线粒体膜电位和溶酶体酸度。

更有趣的是，某些处理（如曲古抑菌素A和巴弗洛霉素A1）甚至诱导出了在正常对照组中从未出现过的、全新的 ESPRESSO 表型。这表明，ESPRESSO 不仅能检测到细胞状态的“量变”，还能识别出由特定压力引起的“质变”。它为我们提供了一种前所未有的工具，能够在活细胞中，通过观察细胞器的反应，来推断外界压力源的作用机制。

实时直播：追踪角质形成细胞的“分化之旅”

前面的实验展示了 ESPRESSO 在静态分析上的强大能力，但它真正的魅力在于捕捉动态过程。细胞分化，是生命从简单到复杂的基石，是一个典型的时空过程。研究人员将目光投向了皮肤中的角质形成细胞 (keratinocytes)。

在体外，可以通过在培养基中加入钙离子来诱导角质形成细胞分化。研究团队以此为模型，对总共73,430个细胞进行了长达22.5小时、每30分钟一次的连续成像。

ESPRESSO 完美地记录了这场分化的“现场直播”。在钙离子诱导下，细胞的 ESPRESSO 表型发生了剧烈的、有规律的演变。随着时间的推移，四个全新的、分化特异性的 ESPRESSO 表型相继出现。有的表型在早期就迅速涌现，而有的则在分化后期才占据主导，揭示了分化过程的异质性和阶段性。

通过对这些分化特异性表型的深入分析，我们看到细胞核的尺寸增加、溶酶体酸度上升，这些变化与体内皮肤分化过程中的观察结果高度一致。更引人注目的是，伴随着表型的时间演变，细胞的空间组织也发生了重塑。原本散乱分布的细胞开始聚集，形成紧密的“斑块”结构，模拟了皮肤组织的形成过程。这个实验充分展示了 ESPRESSO 作为一种“时空组学”技术的真正实力：它不仅识别了新的细胞状态，还描绘了这些状态出现的时间顺序和空间排布，为我们完整地呈现了细胞分化的动态全景。

连接形态与功能：当细胞器状态预言基因表达

ESPRESSO 描绘的细胞器景观，是否仅仅是细胞内在状态的“影子”，还是能与更底层的分子活动，比如基因表达，直接关联起来？这是衡量这项技术深度和价值的关键问题。

为了建立这座桥梁，研究人员选择了一个经典的免疫学过程：巨噬细胞的M1极化。巨噬细胞是免疫系统的“清道夫”，在受到细菌成分脂多糖 (LPS) 刺激后，会极化为促炎症的M1型，并大量表达一氧化氮合酶 (iNOS)，其编码基因为 NOS2。

研究人员使用了一个巧妙的报告细胞系，该细胞系中 NOS2 基因的表达会同步驱动一个荧光蛋白的产生，因此荧光蛋白的亮度直接反映了 NOS2 基因的表达水平。他们用LPS处理这些巨噬细胞，并同时进行了24小时的 ESPRESSO 成像和荧光报告蛋白的监测。

结果令人振奋。LPS 处理后，细胞中涌现出三个在对照组中罕见或不存在的 ESPRESSO 表型（聚类0, 6, 8）。惊人的是，这三个M1极化特异性的表型，无一例外地都表现出极高水平的 NOS2 基因表达！这直接证明了特定的细胞器景观（例如，染色质重组、溶酶体酸度和线粒体膜电位的增加）与关键免疫基因的激活之间存在着强烈的相关性。

借助 ESPRESSO 的时序追踪能力，研究人员甚至更进了一步。他们通过追踪成百上千个细胞的命运轨迹，构建了“细胞状态转移矩阵”。这个矩阵清晰地显示，在LPS刺激下，初始状态的细胞（例如，聚类9）有很高的概率会转向那几个与 NOS2 高表达相关的M1特异性表型。而在对照组中，这些转变则几乎不会发生。

这一发现的意义是深远的。它意味着 ESPRESSO 不仅能识别出与特定基因功能相关的细胞状态，甚至有可能预测哪些细胞“即将”进入该状态。我们第一次能够通过观察细胞器的“肢体语言”，来预判其内在的“分子决策”。

终极考验：一部关于癌症侵袭的3D大片

二维的细胞培养皿毕竟过于简化，生命真正的舞台是三维的。ESPRESSO 能否在更复杂的、更接近体内环境的3D模型中发挥作用？研究人员将最终的挑战设定为三阴性乳腺癌 (TNBC) 的3D肿瘤球侵袭模型。

他们将 TNBC 细胞培养成三维的肿瘤球，并将其包埋在胶原蛋白基质中，模拟肿瘤在体内的生长和侵袭环境。随后，他们进行了长达16小时的连续三维成像。

在立体的肿瘤球中，ESPRESSO 再次展现了其强大的解析力。它清晰地观察到，随着时间的推移，肿瘤球表面的细胞开始向周围的胶原基质中侵袭。更重要的是，ESPRESSO 识别出了两个与这种侵袭行为高度相关的特定表型（聚类0和3）。这些“侵袭者”细胞，在空间上正位于肿瘤球的侵袭前沿，距离肿瘤球中心最远。

这为我们提供了一个靶向癌症侵袭的全新视角。为了验证这一点，研究人员用两种药物处理了这些3D肿瘤球：一种是模拟缺氧的 CoCl₂，另一种是降脂药辛伐他汀（已被报道具有抗癌潜力）。

72小时后，结果的差异一目了然。尽管两种药物都一定程度上抑制了肿瘤球的生长，但它们对侵袭表型的影响却截然不同。CoCl₂ 处理虽然改变了肿瘤球表面细胞的表型（使其溶酶体酸性变得极高），但对那些“侵袭者”细胞却影响甚微，它们依然大量存在。

然而，辛伐他汀的处理则导致了侵袭表型的急剧减少，取而代之的是一种全新的、独特的细胞表型（聚类4）。这表明，辛伐他汀能够有效抑制乳腺癌的侵袭，其机制正是通过特异性地靶向并消除那些具有侵袭能力的细胞亚群。ESPRESSO 不仅揭示了这一机制，也为未来筛选更有效的抗癌侵袭药物提供了一个可视化、可量化的强大平台。

咖啡杯之外：一种细胞生物学的新“语法”？

从分辨细胞身份，到解读应激反应，再到实时追踪细胞分化、关联基因表达，直至在3D模型中解析癌症侵袭，ESPRESSO 在一系列严苛的考验中都交出了出色的答卷。

这项技术的重要性，远不止是提供了一个更先进的观测工具。它为我们思考和定义“细胞状态”提供了一种全新的“语法”。过去，我们用基因表达谱来定义细胞状态，这是一种基于“指令”的语言。而 ESPRESSO 建立了一种基于“执行”的语言——细胞的最终形态和功能，是由其内部的细胞器网络来执行和体现的。

ESPRESSO 与 scRNA-seq 等技术的结合，将为我们带来前所未有的协同效应。scRNA-seq 告诉我们细胞的“意图”（转录本），而 ESPRESSO 则向我们展示了这些意图如何被“执行”为实际的功能状态（细胞器景观），并实时追踪其动态演变。这种从“指令”到“功能”再到“行为”的全链条解析，将极大地加深我们对细胞可塑性、疾病发生和药物响应机制的理解。

当然，ESPRESSO 仍有其局限性，例如染料在致密组织中的穿透性问题，以及目前仅限于四种细胞器的观察。但它所开启的这扇门，通向的是一个能够以时空维度、从功能执行层面理解细胞生命活动的新世界。

下一次，当我们思考一个细胞的身份时，或许我们不仅会问“它在表达什么基因？”，更会好奇地问：“它的细胞器正在讲述一个怎样的故事？” 而 ESPRESSO，正是那位能为我们翻译这个故事的、最出色的“讲解员”。