《自然·免疫学》：CAR-巨噬细胞重大升级！浙大团队开发出能杀伤、能保持抗肿瘤极性的第二代CAR-巨噬细胞

巨噬细胞隶属于先天免疫系统，是免疫第一道防线重要成员，它们不仅能亲自消灭病原体或异常细胞，还能呈递抗原激活其它免疫细胞。于是，浙江大学的张进等人以CD3ζ作为CAR的胞内结构域，为巨噬细胞进行“升级”，使其能够以抗原依赖性方式吞噬肿瘤细胞，于2020首次报道了CAR-巨噬细胞[1]。

在此之后，张进等人进一步对其改良得到第二代CAR-巨噬细胞，研究成果于近日发表在《自然·免疫学》期刊上[2]。

他们将激活吞噬效应的CD3ζ结构域与调控巨噬细胞极性的TIL结构域串联在一起，组成巨噬细胞特异性嵌合抗原受体（M-CAR）的胞内结构，进一步得到第二代诱导多能干细胞来源的工程化CAR-巨噬细胞（CAR-iMAC）。

与第一代相比，第二代CAR-iMAC吞噬功能更强，并能够维持抗肿瘤表型，单独治疗或与CD47抗体联合治疗在实体瘤小鼠模型中具有良好疗效，通过胞葬方式消除肿瘤细胞。

浙江大学的雷安华和余华（现为南昌大学特聘教授）是文章的共同第一作者。

论文首页截图

说起来，在第一代CAR-巨噬细胞中负责激活吞噬效应的CAR结构域CD3ζ，其实是从CAR-T细胞“借”来的，并非专为巨噬细胞量身定制。

不同于T细胞，巨噬细胞的“性格”有些摇摆不定。在趋化因子、化学信号等严格调控下，巨噬细胞可分化为M1、M2两个主要表型，M1型具有较高的抗肿瘤、抗病原能力，吞噬活性、促炎活性、抗原呈递功能更强；M2型则起到抗炎作用，参与组织重塑、愈合和促进肿瘤生长，与肿瘤进展和免疫抑制相关。M1型与M2型之间的转换是可逆的，中间存在过渡态。

第一代CAR-巨噬细胞正是栽在了巨噬细胞的性格多变上，虽然手持利刃，但进了实体瘤里还是难逃被肿瘤微环境诱拐的命运，分化成为促肿瘤的M2型肿瘤相关巨噬细胞。所以说，还是得打造适合巨噬细胞的专用武器才行。

Toll样受体4 （TLR4）为研究者们提供了扭转巨噬细胞“性格”的机会。TLR4在巨噬细胞表面广泛表达，识别到脂多糖后，其胞内的TIR结构域会触发下游信号传递，通过激活NF-κB通路促进巨噬细胞向M1样的促炎状态极化，抑制M2表型。

因此，在此次优化中，研究团队将TIR与CD3ζ整合到一起，构建第二代巨噬细胞特异性嵌合抗原受体（M-CAR），命名为CD3ζ-TIR-CAR。

研发思路

CD3ζ-TIR-CAR相当于是CD3ζ和TIR串联在一起组成CAR的胞内结构域。基于CD3ζ-TIR-CAR，研究团队使用其成熟的iPSC分化巨噬细胞（iMAC）平台和基因工程技术，得到了第二代诱导多能干细胞来源的工程化CAR-巨噬细胞（CAR-iMAC）。

结果显示，相比于CD3ζ-CAR，CD3ζ-TIR-CAR这种串联方式可以进一步增强CAR-iMAC对肿瘤细胞的细胞毒活性，并维持CAR-iMACs的M1型极化状态，提高其抗原提呈能力，显示出更高的IFN-γ反应水平和更低的氧化磷酸化水平。从单细胞RNA测序结果来看，第二代CAR-iMAC的M1样基因表达提高，M2样基因表达被抑制。

在胶质母细胞瘤小鼠模型中，第二代CAR-iMAC能够显著小鼠的颅内肿瘤进展，并延长荷瘤小鼠存活期。在肝细胞癌小鼠模型中，接受第二代CAR-iMAC治疗的8只小鼠中有6只达到完全缓解。

第二代CAR-iMAC的实体瘤疗效

不仅如此，第二代CAR-iMAC治疗后，除了M1型巨噬细胞，肿瘤组织中的T细胞和NK细胞数目也明显增加，树突状细胞则没有，说明第二代CAR-iMAC能够明显改善抑制性肿瘤免疫微环境。肝细胞癌小鼠实验也证明这一点，第二代CAR-iMAC与CD47抗体的组合具有协同效应，仅需低剂量CD47抗体即可取得更优的抗肿瘤效果，联合治疗后10天所有肝细胞癌小鼠表现出显著缓解，30天时肿瘤几乎完全消退。

另外，小鼠实验证明了第二代CAR-iMAC治疗的安全性。值得注意的是，尽管第二代CAR-iMAC治疗会引起IL-6、IL-1等细胞因子水平升高，但没有在小鼠实验中观察到细胞因子释放综合征，这需要在其它人源化模型中进行更多验证。

最后，研究团队探索和完善描述第二代CAR-iMAC抗实体瘤的机制，揭示其以胞葬形式清除肿瘤细胞：肿瘤细胞抗原和CAR的胞外结构域结合后激活胞内串联在一起的CD3ζ、TIR结构域，诱导M1型极化和肿瘤坏死因子的分泌，从而诱导肿瘤细胞凋亡，巨噬细胞再通过胞饮作用吞噬和消化肿瘤细胞的凋亡残体。

CAR-iMAC通过胞葬形式清除肿瘤细胞

目前，CAR-T细胞在血液肿瘤的效果已经得到证实，而面对实体瘤仍是心有余而力不足，部分可归因于免疫抑制性的肿瘤微环境。越来越多的研究表明，实体瘤组织中免疫细胞主要成员、具有极性的巨噬细胞，是解决实体瘤免疫治疗耐药的突破口。

首个CAR-巨噬细胞用于治疗实体瘤的临床试验已经开启[3]，张进等人更是在这项研究中进行优化，开发出第二代CAR-巨噬细胞，为癌症免疫治疗提供极具潜力的新策略。

参考文献：

[1]Zhang, L., Tian, L., Dai, X. et al. Pluripotent stem cell-derived CAR-macrophage cells with antigen-dependent anti-cancer cell functions. J Hematol Oncol 13, 153 (2020). https://doi.org/10.1186/s13045-020-00983-2

[2]https://www.nature.com/articles/s41590-023-01687-8

[3]Chen, Y. et al. CAR-macrophage: a new immunotherapy candidate against solid tumors. Biomed. Pharmacother. 139,111605 (2021).