Nature子刊：刘涛团队开发基于RNA编辑的密码子扩展，用于内源蛋白质标记

北京大学刘涛团队在 Nature Chemical Biology 期刊发表了题为：Tracking endogenous proteins based on RNA editing-mediated genetic code expansion 的研究论文。

该研究开发了基于RNA编辑介导的非经典氨基酸（ncAA）蛋白质标记方法——RENAPT，RNA编辑系统在不改变基因序列的同时，实现在目标蛋白mRNA水平引入终止密码子，且不受PAM序列的限制。然后通过非经典氨基酸系统，将荧光ncAA或具有生物正交反应手柄的ncAA进行后续染料标记在活细胞中，仅使用最小的氨基酸侧链标签，实现特异性地标记多种内源蛋白质（图1）。

该研究扩展了内源蛋白标记方法，提供了一个广泛适用的平台，可以在活细胞中标记内源蛋白质，以研究其定位和功能。

图1：RENAPT系统在活细胞中标记内源蛋白

1、RENAPT系统用于标记内源蛋白

为了在活细胞水平实现内源蛋白的实时示踪，作者首先验证了RNA编辑系统实现C到U的编辑效率，然后通过肽段质谱，确认了ncAA可以位点特异性的整合到目标蛋白中。然后选择内源蛋白GRP94的不同位点进行了标记验证（图2）。

图2：RENAPT系统蛋白标记验证

直接观察蛋白质定位可以为研究蛋白质功能和相互作用提供重要的信息，因此，作者使用了一组已知亚细胞定位的内源蛋白，利用RENAPT系统进行实时标记。可以观察到目标内源性蛋白质（GRP94Q452UAG、ATP5AQ439UAG和IGF2-RQ506UAG）与各自的亚细胞定位荧光探针呈强烈的共定位信号（图3）。

图3：RENAPT用于不同内源蛋白的亚细胞定位

2、RENAPT系统进行蛋白双标记

双标记系统在蛋白标记中的应用可以帮助研究人员更全面地理解蛋白质的功能、相互作用和定位。组蛋白H3.3a和H3.3b分别由H3f3a和H3f3b基因编码，它们在氨基酸序列上完全相同，但碱基序列不同。利用RENAPT系统，可以区分这2个蛋白，并对其分别进行标记，如图4a所示。通过使用双标记系统，研究它们在细胞内的定位。随后，研究团队对溶酶体蛋白IGF2-RQ506UAG和线粒体蛋白ATP5AR330UGA进行了双标记（图4b）。

图4：RENAPT双标记系统。a. 双标记histone H3.3a-mCherry 和 histone H3.3b-eGFP蛋白. b. 双标记内源ATP5A 和 IGF2-R蛋白

3、RENAPT系统用于超分辨成像

作者通过HIS-SIM超分辨成像系统对内源蛋白ATP5AQ439UAG、IGF2-RQ506UAG和GRP94Q452UAG进行超分辨成像（图5），得到了与相应的亚细胞荧光探针光谱重叠高度的共定位结果，PCC系数值在0.77-0.97之间。证明RENAPT系统可以用于超分辨成像的研究，可以帮助我们更清晰地观察和研究细胞器和亚细胞结构、更深入地理解细胞内蛋白质的结构和功能，并为生命科学研究提供更多的可能性。

图5：利用RENAPT进行超分辨成像

4、RENAPT系统用于原代海马细胞内源蛋白标记

利用RENAPT系统，实现对神经细胞内源蛋白的高分辨率、高灵敏度和长时间的动态成像。Nav1.6负责神经元动作电位的起始和传导，并通过与ankG膜结构域相互作用而聚集在AIS远端。与ankG和Nav1.6抗体染色的共定位分析表明，RENAPT可以有效地标记Nav1.6（图6）。类似地， Cav2.1和NFL分别与对应的抗体和神经标记物微管相关蛋白2（MAP2）进行标记，研究共定位效果。这些结果证实，RENAPT可以成功地标记原代海马细胞中的内源性蛋白，这将有助于今后对它们表达、定位、相互作用和功能进行研究。

图6：RENAPT用于小鼠海马细胞内源蛋白标记

总结

该研究开发的RENAPT系统，跨越了传统的内源蛋白标记技术，直接在RNA水平实现对内源目标蛋白是实时示踪标记，扩展了内源蛋白质标记的方法，为更清晰地观察细胞结构和蛋白质分布提供了新的平台。文章首次结合RNA编辑与非经典氨基酸整合技术应用于内源蛋白标记系统，并且可以应用于神经细胞中目标蛋白的标记，期待未来科学家能够进一步拓展该系统在其他方面的应用。

北京大学药学院博士后郝敏为论文的第一作者，研究方向为合成生物学、碱基编辑和基因密码子扩展技术等，博士生凌鑫宇和讲师孙懿为论文共同第一作者。北京大学药学院刘涛研究员为论文通讯作者。该研究获得中国国家重点研发计划、国家自然科学基金、国家科技重大专项计划、中国博士后科学基金和北京市自然科学基金等项目的支持。