Mol Cell ：给蛋白质修饰“拍单分子身份证”：重庆大学杨爱民等开发纳米孔PALM-Scan，直接读取棕榈酰化

蛋白质组作为一个动态实体存在，其功能复杂性不仅通过基因产物的多样性，还通过翻译后修饰（PTMs）的精妙交响而呈指数级扩展。其中，蛋白质S-棕榈酰化（也称S-酰化）代表一种可逆的PTM，其中长链脂肪酸（如棕榈酸）通过硫酯键共价连接到特定半胱氨酸残基。

在哺乳动物细胞中，S-棕榈酰化由含锌指Asp-His-His-Cys结构域的棕榈酰酰基转移酶（ZDHHC）家族酶促安装，而去棕榈酰化由酰基蛋白硫酯酶执行。这种动态的“棕榈酰化循环”作为基本分子开关发挥作用，对蛋白质膜关联、稳定性、蛋白质-蛋白质相互作用和亚细胞定位赋予时空调控。

S-棕榈酰化是一种极其普遍的修饰，估计高达10%–20%的人类蛋白质组可能受此修饰。S-棕榈酰化的失调——无论是表现为异常的获得还是丧失——日益被牵涉于多种人类疾病的发病机制中，包括癌症、炎症性疾病和神经退行性疾病。

尽管S-棕榈酰化在健康和疾病中的重要性已被确立，但对其在细胞和组织水平上的准确定量仍然是一个艰巨的挑战。缺乏能够识别S-棕榈酰化的商业可用抗体已严重限制了该领域的进展。

目前，两种主要技术主导检测领域：酰基-生物素交换（ABE）分析和生物正交脂质探针的代谢标记。在ABE工作流程中，游离半胱氨酸硫醇被N-乙基马来酰亚胺不可逆地封闭。推定的S-棕榈酰化位点随后经羟胺（HAM）选择性切割，新暴露的硫醇被生物素化。

所得生物素标记蛋白随后通过基于链霉亲和素的蛋白质印迹进行分离或检测。相比之下，代谢标记依赖于炔标记脂肪酸类似物在细胞中掺入棕榈酰化蛋白，随后通过铜(I)催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）偶联生物素-叠氮标签以进行下游捕获或可视化。

两种方法均具有根本性局限。它们本质上是间接的，依赖于总体平均，同时技术上要求高。除实际限制外，ABE分析及其衍生技术易受不完全硫醇封闭或HAM对其他硫酯连接物种的脱靶切割产生的假阳性信号影响。

代谢标记本质上受限于其对脂肪酸类似物的细胞摄取和代谢掺入的依赖性，这导致不完全的S-棕榈酰化谱分析，并将其用途限制于活细胞或代谢活性系统。更关键的是，这些技术通常需要大量蛋白输入，这一要求常与生物医学标本的有限材料不相容。

这些根本性局限强调了一个紧迫的未满足需求：一种能够从微量样品中直接定量特定蛋白棕榈酰化状态的技术。这样的方法将弥合大规模发现与病理生理相关背景下S-棕榈酰化聚焦验证之间的差距。

纳米孔传感已成为单分子分析的强大工具，主要归因于其无标记性质，这保留了生物分子天然状态并避免了复杂的样品制备。除单纯检测外，该技术将分子电荷、大小或疏水性的细微变化转导为可区分的电信号，从而实现精细构象和物理化学差异的分辨。

重要的是，这些内在敏感性已将纳米孔确立为一个多功能、统一的平台，用于探究多种蛋白质PTMs，包括磷酸化、乙酰化和酪氨酸硫酸化，其中不同的修饰类型赋予独特的分子指纹，可在单分子水平上直接解码。

与这些小基团PTMs不同，S-棕榈酰化在底物上附加了一条长疏水酰基链，显著增加了其分子体积和疏水性。这些显著改变预期会在纳米孔测量中产生显著且独特的离子电流信号。

图1.基于纳米孔检测s -棕榈酰化的PALM-Scan平台的设计（摘自Molecular Cell）

在此，作者介绍并实验验证了PALM-Scan（通过纳米孔上无标记监测和特征捕获进行棕榈酰化分析）——一种用于直接、无标记分析S-棕榈酰化的策略。基于纳米孔传感的基础原理，该平台实现了跨多种模型肽的不依赖序列的S-棕榈酰化识别，并以单分子分辨率解析了去棕榈酰化异质性和动力学。

作者进一步证明，PALM-Scan可同时区分同一肽支架上三种功能不同的半胱氨酸导向PTMs，包括S-棕榈酰化、S-亚硝基化和S-谷胱甘肽化，无需修饰特异性探针或富集步骤。此外，作者通过同时检测和区分疾病相关天然生物标志物（包括来源于beclin-1（BECN1）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的肽）的棕榈酰化与非棕榈酰化形式，验证了该平台的转化潜力。

最后，作者在小鼠血清样品中成功检测了天然GFAP S-棕榈酰化。通过独特地整合无标记操作和实时单分子分析且样本需求极小，PALM-Scan为基础生物学和生物医学应用中研究蛋白质S-棕榈酰化建立了一个变革性平台。

参考消息：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(26)00505-8