清华大学刘俊杰为基因编辑做减法，无需蛋白质的基于RNA核酶的新一代基因编辑工具

清华大学生命学院刘俊杰（Jun-Jie Gogo Liu）课题组在国际顶尖学术期刊 Science 期刊发表了题为：Hydrolytic endonucleolytic ribozyme (HYER) is programmable for sequence-specific DNA cleavage 的研究论文。

该研究报道了一种新型基因编辑工具——HYER（水解型内切核酶），仅由具有催化活性的RNA（核酶）构成，HYER可序列特异性地切割RNA和DNA底物，并在哺乳动物细胞基因组中产生位点特异性的编辑。研究团队还通过理性设计，获得了工程化HYER，具有更高的特异性和灵活性。这也是科学界首次报道具有DNA水解切割能力的核酶。

HYER对底物的识别和切割仅依赖于RNA分子，而无需蛋白核酸酶参与，由于具有良好的可编程性，HYER有望成为继CRISPR之后的新一代基因编辑底盘工具。

刘俊杰研究员

刘俊杰，2011本科毕业于四川大学，2017年博士毕业于清华大学，此后曾在诺奖得主、CRISPR基因编辑先驱 Jennifer Doudna 教授实验室进行博士后研究，在此期间作为第一作者发表 Nature 论文，开发了一种基于CRISPR-Cas12e的小型化基因编辑工具——CasX，CasX转化的基因编辑疗法公司Scribe Therapeutics已完成超1亿美元融资，并与礼来、赛诺菲等制药巨头达成大额合作。

2020年10月，刘俊杰加入清华大学生命学院，成立了独立实验室。2023年1月，刘俊杰团队在 Cell Research 期刊发表论文，开发了基于CRISPR-Cas12l的小型化基因编辑工具——Casπ。2023年6月，刘俊杰团队在 Cell 期刊发表论文，解析了R2逆转座子在基因组上跳跃和切割DNA的分子机制，为开发基于逆转座子的新型基因编辑工具奠定了基础。

值得一提的是，在这篇 Cell 论文中，刘俊杰团队还将来自低等真核生物的R2逆转座子与其祖先（原核生物第二类内含子，GII intron）及哺乳动物中的LINE-1逆转座子进行了比较，发现第二类内含子向R2逆转座子及进一步向LINE-1逆转座子进化的过程中，RNA的结构性组分逐渐减少并被编码区域所取代，并且催化功能逐渐从以RNA为主导过渡到以蛋白质为主导。

1980年代，Thomas Cech 和 Sidney Altman 等人发现并证明了RNA也可以发挥催化作用，即所谓的核酶（Ribozymes），他们也因此获得了1989年的诺贝尔化学奖。

第二类内含子（GII intron）逆转座子，特别是它们编码的内含子RNA，是一类能够在宿主基因组通过“复制-粘贴”进行逆转座的可移动遗传元件，该元件通常编码一个兼具核酸内切酶（EN）和逆转录酶（RT）活性的蛋白质以及一个RNA分子，通过形成蛋白核酸复合物（RNP）来执行在宿主基因组中的逆转座扩增。

GII内含子可分为A、B、C三类，其中GII-C型内含子的大小仅为GII-A和GII-B的一半，被认为在进化上更古老。此前有研究发现，存在天然的缺乏开放阅读框（ORF）的GII内含子，它们被认为是GII内含子的“退化和无功能后代”，并且缺乏表征。迄今为止，广泛使用的GII内含子数据库仅列出了42个经生物信息学分析确定的缺乏ORF的GII-A和GII-B，尚未报道缺乏ORF的GII-C内含子。

刘俊杰团队对公开可用的细菌基因组序列进行初步筛选，发现许多缺乏ORF的GII-C型内含子，其中一些还在细菌基因组中存在多个拷贝，这表明，这些内含子编码的为唯一组分——RNA分子，可能在不依赖蛋白质的情况下仍然具有扩增位点识别和切割DNA的能力，从而通过“复制-粘贴”机制在基因组中进行拷贝扩增。

不含蛋白组分的GII内含子RNA在基因组中“复制-粘贴”的假设示意图

进一步研究显示，这些长度约600nt的RNA分子在广谱的离子浓度和温度范围内，具有显著的RNA和DNA水解切割活性。因此，研究团队将这些RNA分子命名为水解型内切核酶（Hydrolytic Endonucleolytic Ribozyme，HYER），这是科学界首次报道具有DNA水解切割能力的核酶（Ribozyme）。

研究团队利用冷冻电镜获得了HYER1的高分辨三维结构（3.0Å分辨率），并解析了其水解切割DNA的机制，HYER1通过一段暴露的单链RNA（6nt）区域——目标识别位点（TRS），来识别并招募DNA底物，将DNA捕获在结构域V所形成的催化核心中，通过经典的双镁离子机制催化DNA水解，这表明了HYER是一种TRS引导的序列特异性DNA内切酶，其主要切割位点位于TRS-DNA互补区下游0或1 nt处。

HYER的DNA切割能力

研究团队进一步验证了HYER在细胞内的DNA切割能力，在大肠杆菌和人HEK293T细胞内分别构建了ccdB毒蛋白报告系统和移码嘌呤霉素抗性基因（puro*）报告系统。结果显示，HYER可以在细胞内，尤其是真核细胞基因组中引入DNA双链断裂（DSB）并产生编辑效果。

HYER在大肠杆菌和人类细胞中切割DNA双链

天然HYER仅使用TRS识别6nt的DNA区域，这限制了其精准基因编辑的能力。研究团队基于HYER的三维结构，进行了多种理性设计。例如，可根据底物序列，灵活设计目标识别位点（TRS）的序列和长度；在TRS临近区域插入14nt的底物招募序列（Recruiting Sequence，RS），可明显提高HYER1的底物识别特异性和切割效率；对回文序列和TRS进行改造， HYER1则可形成带有两个不同TRS的异源二聚体，靶向双链DNA底物的不同区域，产生了具有5'突出、3'突出或平末端的定制化切割产物。这表明了HYER具有良好的可编程性，具有相当大的改造空间。

多种理性设计提高了HYER1的底物识别特异性和切割效率

最后，受“RNA世界”（RNA World）假说的启发，研究团队提出了第二类内含子（GII intron）中的“RNA的催化功能逐渐被蛋白质取代”的分子进化历程：在进化过程中，GII intron的结构域IV逐渐扩大，并产生了可编码短肽的开放阅读框（ORF），而这些短肽可作为顺式元件与内含子RNA相互作用，增强其结构稳定性和催化活性；随着ORF变得更长，更为成熟，其编码的蛋白质不仅起到稳定结构的作用，亦获得了DNA切割和逆转录活性，以替代RNA核酶行使催化功能。

第二类内含子的进化假想

总的来说，该研究阐明了HYER的DNA靶向切割机制，其与众所周知的RNA引导的CRISPR-Cas核酸酶相似，使用可重编程的单链RNA进行DNA识别，并通过水解来切割DNA。相比广泛使用的CRISPR核酸酶的3-4kb的大小，HYER要紧凑得多，仅~0.6kb，因此更容易通过体外转录获取。

目前，天然HYER在体内编辑活性还很低，最有可能是因为其对双链DNA（dsDNA）的解旋能力有限。但正如我们在CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12f1等蛋白质核酸酶中所看到的那样，通过基因工程改造以提高体内基因编辑活性是可行的。

这项研究不仅拓展了科学界对RNA World假说和RNA催化功能的理解，也为创制具有中国完全自主知识产权的用于基因编辑和RNA编辑的新一代核酸操纵底盘工具奠定了基础。