徕卡多光子显微镜免疫学应用：揭示巨噬细胞发挥血小板功能的机制

javascript:void(0);/*1630566298548*/高端仪器之所以受到顶尖科学家们的青睐，不仅因为它们在日常使用中表现出的稳扎稳打，还因为其在捕捉关键性创新实验结果时带来的无限可能。今天，我们通过解读加拿大卡尔加里大学（University of Calgary）的徕卡多光子显微镜用户近期在《Science》杂志上发表的题为“Primordial GATA6 macrophages function as extravascular platelets in sterile injury”的研究论文[1]，感受一下徕卡DIVE（Deep In Vivo Explorer）多光子显微镜在体成像的“速度与激情”。

研究背景

巨噬细胞（Macrophages或Mø）是髓系来源的终末分化免疫细胞，通常定居于组织并具有吞噬清除病原体的能力。由于受到微环境的影响，不同组织内的巨噬细胞可分化为不同的亚型，其活化形式也不尽相同[2]。研究发现，在哺乳动物体腔内存在大量转录因子GATA6阳性的空腔巨噬细胞（Cavity macrophages）,它们悬浮在腔体液中并能通过聚集成凝块的方式锚定并清除细菌[3,4]。作者的研究主要围绕这个巨噬细胞亚群展开。

2016年，作者发现这群GATA6+巨噬细胞能在体腔内行使组织修复功能[5]，但其向损伤部位的趋化和募集机制尚不清楚。作为系列研究中的一环，在这篇文章中，作者大量运用在体成像技术，在小鼠模型中捕捉到GATA6+巨噬细胞参与腹腔损伤修复的过程，并发现这类巨噬细胞通过发挥血小板的功能来帮助机体应对无菌性损伤（Sterile injury）。


研究简述


视频1. 腹腔巨噬细胞向损伤部位募集

通过视频1，作者向我们展示了巨噬细胞募集到损伤部位并形成栓塞的全过程。要捕捉这一动态生理过程，作者首先克服的难题是腹腔损伤区域的在体成像（图1B）。成像工作在一台倒置的DIVE（Deep In Vivo Explorer）多光子系统上进行，实验人员精确地采集了腹膜、腹腔和腹直肌内部细胞运动的图像。通过对腹腔巨噬细胞募集过程进行分析，作者发现该过程独特存在于腹腔内且必须依赖于流动的腹腔液环境（图1D-I）。整个过程耗时30分钟，直至巨噬细胞将损伤部位完全“堵塞”（图1L）。在这个过程中，巨噬细胞是采用一种快速运动方式进行募集，部分细胞只耗时0.04秒即可移动60微米距离并精准靶向损伤位点（图1J）。

图1. 腹腔损伤部位在体成像

接下来，作者将腹腔损伤部位巨噬细胞的募集过程和损伤血管内血小板的募集过程进行对比。结果显示，两者不仅在形态学上非常相似（视频2，图2A&B），且均能被EDTA所阻断或被钙离子+ATP增强（图2E-H）。另外，腹腔损伤部位的3D重构结果显示，腹腔内壁损伤部位主要发生巨噬细胞募集，而外壁则主要发生血小板募集（图2D）。至此，可以确定这群GATA6+巨噬细胞在腹腔中扮演着血小板的角色，在损伤初期腹膜组织栓塞形成过程中发挥重要作用。


视频2. 巨噬细胞和血小板向损伤部位募集


图2. 巨噬细胞和血小板向损伤部位募集对比

随后，作者通过一些系列实验，确定了GATA6+巨噬细胞的损伤应答并不依赖于经典哺乳动物细胞黏附分子（整合素等）发挥功能，而是通过更“原始“的清道夫受体（Scavenger receptors）的半胱氨酸富集区（SRCR结构域）发挥作用（结果见研究原文）。

最后，作者在术后疤痕结痂模型中探索了GATA6+巨噬细胞募集机制在临床应用方面的前景。结果显示，术后伤口组织的GATA6+巨噬细胞募集会造成疤痕的产生（图3D-G），导致伤口处间皮增生（Mesothelial recruitment）和后续胶原沉积（Collagen deposition）。适当抑制GATA6+巨噬细胞行使血小板功能可以作为促进术后创面愈合的潜在靶点（结果详见原文）。

图3. 巨噬细胞超快速募集和疤痕形成

徕卡DIVE系统对本研究的助攻

不得不说，作者对徕卡DIVE显微镜的使用已达到炉火纯青的地步，使DIVE的优势在本文中体现得淋漓尽致。为了增进对这台专精于组织深层显微成像系统的了解，我们就来看看DIVE是如何助攻这篇《Science》大作的。

图4. 徕卡DIVE成像系统4Tune检测器

徕卡4Tune外置RLD检测器：检测范围自由可调的光谱型检测器。

精准检测二次谐波

本文中相当一部分组织成像采用了二次谐波（Second Harmonic Generation，SHG）信号作为组织内参信号。SHG信号无需标记、信号强度不受光漂白影响且在纤维、胶原等丰富的组织中广泛存在，是多光子成像常用的组织标记。其成像难点在于：传统的双光子系统的滤片式成像无法避免SHG成像时荧光信号共激发导致的串色问题。徕卡DIVE使用4Tune检测器（图4）不仅能通过移动检测范围确定SHG信号的真实性，还能轻松地为每个样品找到最适合的SHG检测波段。 

灵活设置多色成像

本文中作者使用了多个荧光蛋白转基因小鼠品系，如：Gata6H2B-Venus小鼠、LysMeGFP小鼠、Ly6GCre-tdTomato小鼠和Csf1RHBEGF/mCherry小鼠等。面对这些激发和发射光谱完全不同的荧光蛋白，只有检测范围灵活可调的成像系统才能胜任本文中多重荧光加SHG检测的任务。这里，不得不为徕卡DIVE系统的检测灵活性点个赞。

快速成像&三维重构

在本文中，还有一些对成像速度要求很高的检测任务，如需要快速捕捉巨噬细胞运动的轨迹和短时间内完成损伤部位三维数据的采集等。在这些应用场景中，DIVE的快速成像功能就非常好用了。配合共振扫描振镜，DIVE帮助作者实现了巨噬细胞0.04秒内运动轨迹的追踪（图1J，每0.02秒成像一次）。

结语

当然，徕卡DIVE成像系统的优势技术还有很多（如多光子荧光寿命成像等），结合新上市的STELLARIS共聚焦平台，徕卡DIVE成像系统将以更优秀的状态帮助越来越多的科学家们探索生命的奥秘。（生物谷 bioon）

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徕卡 STELLARIS DIVE 

参考文献：
[1] Zindel J ,  Peiseler M ,  Hossain M , et al. Primordial GATA6 macrophages function as extravascular platelets in sterile injury[J]. Science, 2021, 371.
[2] Ghosn E ,  Cassado A A ,  Govoni G R , et al. Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets[J]. PNAS, 2010, 107(6).
[3] Cassado A A , D'Império Lima MR,  Bortoluci K R . Revisiting Mouse Peritoneal Macrophages: Heterogeneity, Development, and Function[J]. Frontiers in immunology, 2015, 6:225.
[4] Zhang N ,  Czepielewski R S ,  Jarjour N N , et al. Expression of factor V by resident macrophages boosts host defense in the peritoneal cavity[J]. Journal of Experimental Medicine, 2019.
[5] Jing, Wang, Paul, et al. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair[J]. Cell, 2016.