Nature Biotechnology：便便里藏着肠道的“实时弹幕”？Foli-seq技术让“粪”土变黄金

肠道：最熟悉的“黑箱”与“有创”的窥探

肠道黏膜是人体更新换代最快的组织之一，每天约有上百亿个肠道上皮细胞和免疫细胞会自然凋亡、脱落，并混入粪便中排出体外。这些脱落的细胞，如同战场上散落的信笺，携带着关于肠道健康、免疫状态和疾病活动的宝贵情报。这个由脱落细胞物质构成的宝库，被研究人员称为“粪便脱落组”(fecal exfoliome)。

理论上，通过分析这些细胞中的RNA，我们就能无创地洞悉肠道内部的分子动态。RNA是基因表达的直接产物，它能告诉我们哪些基因在何时何地被激活或抑制，从而描绘出一幅动态的、功能性的生理或病理图像。这远比仅仅知道存在哪些基因（DNA层面）或哪些微生物（微生物组层面）要深刻得多。

然而，理想很丰满，现实却异常骨感。从粪便中捕获并分析宿主RNA，长期以来被认为是一项几乎不可能完成的任务，主要面临三大技术障碍：

1. 信号极其微弱且极易降解：肠道环境复杂，充满了各种消化酶和微生物，宿主RNA一旦脱落，很快就会被降解成碎片，难以捕获到完整的转录本信息。

2. “噪音”的压倒性优势：粪便中99%以上的RNA都来自细菌等微生物。传统的RNA测序技术，如基于poly-A尾巴的捕获方法，在面对这种“菌多主少”的局面时，会捞起海量的微生物RNA“噪音”，而真正有价值的宿主RNA信号则被彻底淹没。研究数据显示，使用传统方法，最终能比对到宿主基因组的序列读长 (reads) 往往不到总数的5%，效率极低。

3. 定量分析的困境：即便侥幸捕获到一些宿主RNA，由于样本处理过程中的RNA损失和PCR扩增偏好，也很难对其进行精确的定量分析，无法准确判断特定基因表达水平的真实变化。

正因为这些难以逾越的鸿沟，肠道的“实时弹幕”虽然每天都在刷新，我们却始终无法接收和解读。

Foli-seq的诞生：于万千“噪点”中捕捉宿主的回响

面对挑战，研究人员转换了思路。既然无法避免微生物RNA的“噪音”，何不干脆绕过它们，只去“收听”我们感兴趣的宿主“频道”？Foli-seq技术的核心便在于此，它采用了一种巧妙的靶向扩增 (targeted amplification)策略。

想象一下，在一个无比嘈杂的派对上，你想听清特定几个人的对话。你不会试图调高所有声音，而是会使用一个定向麦克风，分别对准你的目标。Foli-seq正是这样做的。研究人员首先设计了数百对特异性引物 (primers)，这些引物如同精确制导的“分子钩子”，能够精准地识别并结合到他们预先选定的宿主基因转录本 (cDNA) 上。这些基因经过精心挑选，涵盖了与免疫、炎症、细胞类型、组织功能等密切相关的关键分子，一次实验可以同时靶向500到800个基因。

通过后续的聚合酶链式反应 (PCR)，只有这些被“钩住”的宿主基因片段会被大量复制，而海量的微生物RNA由于没有对应的引物，则被完全忽略。这种方法从根本上解决了信噪比的问题。论文数据显示，Foli-seq技术在小鼠粪便样本中实现了高达 90.9% 的宿主基因组比对率，相比传统方法提升了一到两个数量级。在人类粪便样本中，也达到了同样出色的 90.4%。

为了确保分析的准确性和定量能力，Foli-seq还融入了两项关键设计：

第一，外参“标尺”：在RNA提取之初，研究人员会加入已知浓度的外源RNA标准品 (External RNA Controls Consortium, ERCC)。通过分析这些标准品的最终读数，可以校正样本处理过程中可能引入的系统误差，实现对基因表达水平的绝对定量。实验证明，Foli-seq测得的ERCC转录本水平与商业来源的真实浓度在五个数量级范围内高度吻合 (R² = 0.872)。

第二，扩增“身份证”：为了消除PCR扩增过程中可能存在的偏好（某些片段可能更容易被扩增），他们在每个扩增子 (amplicon) 上都标记了一个独特的分子标签 (Unique Amplicon Identifier, UAI)。最后通过计算UAI的数量而非测序读长的数量，来还原每个转录本的原始丰度，大大提高了定量的准确性。

一系列严格的验证实验表明，Foli-seq不仅灵敏、准确，而且非常稳定。技术重复样本之间的基因表达水平高度相关 (R² = 0.945)，生物学重复样本（来自同一笼内不同小鼠）的相关性也同样出色 (R² = 0.878)。更重要的是，粪便Foli-seq的检测结果与“金标准”，直接取小鼠结肠组织进行的RNA测序 (RNA-seq) 结果，也表现出良好的相关性 (R² = 0.615)。这有力地证明了，从粪便中“听”到的，确实是肠道组织正在“说”的。

此外，研究人员还发现，脱落的细胞信号主要来源于下消化道（约93.8%），这也符合粪便在结肠中形成的基本生理过程。这项技术为无创、动态、精准地监测肠道健康铺平了道路。

小鼠肠道“现场直播”：Foli-seq如何追踪一场“肠道风暴”的起落

为了检验Foli-seq在真实疾病模型中的威力，研究团队在三种经典的结肠炎 (colitis) 小鼠模型中进行了实战演练。这三种模型分别模拟了化学损伤（葡聚糖硫酸钠，DSS诱导）、病原体感染（啮齿类柠檬酸杆菌，C. rodentium感染）和免疫失调（抗CD40抗体诱导）三种不同类型的肠道炎症。

这项研究最激动人心的部分在于其纵向采样 (longitudinal sampling)的设计。在整个疾病发生、发展和恢复的过程中，研究人员可以每天收集同一只小鼠的粪便样本进行分析，从而绘制出连贯的、动态的分子变化图谱。这是传统组织活检无法实现的，因为你不可能每天都对同一只小鼠进行肠镜取样。

通过主成分分析 (Principal Component Analysis, PCA) 对比不同时间点的转录组数据，一幅清晰的“疾病轨迹图”呈现在眼前。在炎症初期，所有模型小鼠的粪便转录组都迅速偏离了健康的“基线”状态。随着疾病进展，它们沿着各自独特的路径移动。例如，在DSS模型中，肠道屏障破坏的信号尤为突出；在 C. rodentium 感染模型中，则看到了强烈的抗感染防御反应。而在恢复期，这些轨迹又都逐渐向着基线状态回归，直观地展示了肠道从损伤到修复的完整过程。

Foli-seq不仅能区分不同模型的宏观轨迹，还能揭示其内在的分子细节。研究人员发现，在炎症最严重时，三种模型共有 89个 差异表达基因 (Differentially Expressed Genes, DEGs)，这些基因大多与T细胞介导的免疫 (Coro1a)、趋化因子 (Cxcl3, Cxcr2) 和广谱炎症标志物 (S100a9, Lcn2) 相关，反映了肠道炎症的共同核心通路。

然而，更有趣的是每个模型的“独家”信号。DSS模型有8个独特的DEGs，C. rodentium 模型有38个，而抗CD40模型则高达58个。这些独特的基因签名，精准地反映了不同病因驱动下的特异性病理生理机制。例如，在抗CD40模型中，与辅助性T细胞相关的趋化因子 Ccl20 的上调非常显著，这与之前在溃疡性结肠炎患者中的发现一致。

这项工作证明，Foli-seq能够像一部高清摄像机，实时、无创地“直播”肠道内部的炎症风暴，捕捉其从酝酿、爆发到平息的全过程，并以分子级别的分辨率揭示其背后的复杂机制。

洞察未来：粪便RNA能否预测治疗效果？

监测疾病进程固然重要，但Foli-seq的潜力远不止于此。它能否用于评估治疗反应，甚至预测治疗效果？为了回答这个问题，研究人员设计了一个巧妙的治疗实验。

他们选择了抗CD40诱导的结肠炎模型。这是一种由免疫系统过度激活驱动的炎症，其中一种名为白细胞介素-23 (Interleukin-23, IL-23) 的细胞因子扮演着关键的“煽风点火”角色。目前，靶向IL-23 p19亚基的抗体药物（如Risankizumab）已在临床上用于治疗炎症性肠病 (Inflammatory Bowel Disease, IBD)。研究人员便在小鼠模型中模拟了这一治疗过程：一组小鼠只注射抗CD40抗体（对照组），另一组则同时注射抗CD40和抗p19抗体（治疗组）。

结果正如预期，接受抗p19治疗的小鼠，其肠道炎症得到了显著缓解，体重恢复也更快。而Foli-seq的每日监测，则从分子层面完美地印证了这一表型变化。治疗组小鼠的粪便转录组在第10天时，已经比对照组更接近于治疗前的健康状态。

更深层的洞见来自于对信号通路的解析。IL-23发挥作用，需要激活下游的STAT3信号，并诱导产生另一种细胞因子IL-22。Foli-seq的检测结果显示，尽管两组小鼠体内的 Il23a (p19的基因) 表达都同样升高，但在治疗组中，其下游关键分子 Il22 的表达在第5天就已恢复正常，而对照组则持续高企至第8天。这清晰地表明，抗p19药物精准地“掐断”了IL-23信号的向下传导，Foli-seq成功地捕捉到了这一药物靶向作用的直接证据。

最令人振奋的发现，是Foli-seq展现出的 预测潜力。研究人员注意到，即使是在遗传背景完全相同、接受相同处理的对照组小鼠中，它们在第10天时的疾病严重程度也存在差异，这与临床上IBD患者对疾病进程和治疗反应的异质性非常相似。他们大胆假设：是否可以从治疗开始前（第0天）的粪便样本中，找到预示未来疾病结局的“蛛丝马迹”？

通过对第0天的基因表达数据和第10天的体重变化进行回归分析，他们真的找到了！两个基因：Ccl3 和 Cd52，在第0天的表达水平与第10天的体重减轻程度呈现出显著的负相关。也就是说，在炎症尚未完全爆发时，那些粪便中这两个基因表达水平较高的小鼠，未来会经历更严重的体重下降。

Ccl3 编码一种促进中性粒细胞聚集的促炎蛋白，而 Cd52 则与免疫细胞功能有关。这一发现意义重大：它意味着我们或许有朝一日能够通过分析患者治疗前的一份粪便样本，来预测其疾病的严重程度或对特定疗法的反应，从而为实现真正的个性化精准医疗提供关键决策依据。

不再“鸡同鸭讲”：倾听宿主与微生物的“双向奔赴”

肠道的故事，从来都不是宿主一个人的独角戏。肠道微生物与宿主之间存在着复杂而深刻的相互作用。传统研究往往将两者割裂开来，要么只看微生物组，要么只看宿主反应。Foli-seq的出现，使得将两者整合在同一时空维度下进行考察成为可能。

研究团队对一组健康小鼠进行了长达6周的连续监测，每周收集粪便，同时进行Foli-seq和16S rRNA基因测序（用于分析微生物群落结构）。通过分析宿主基因表达和微生物丰度在时间序列上的共变关系，他们构建了一张前所未有的宿主-微生物动态互作网络图。

这张网络图揭示了许多有趣的关联。例如，一种名为 Dubosiella 的细菌，其丰度变化与宿主多种炎症基因（如 S100a9）的表达呈现出强烈的正相关，暗示它可能在调控肠道的基础免疫状态中扮演角色。而宿主分泌的抗菌肽基因 Reg3g 的表达，则与另一种名为 Caproiciproducens 的细菌丰度正相关。

相关性不等于因果性。为了验证网络图的预测能力，研究人员进行了一项靶向定植实验。他们找到了一群肠道内不含 Dubosiella 属细菌的小鼠，然后通过口服灌胃的方式，给它们接种了从鼠肠中分离出的 Dubosiella newyorkensis。接种后，他们再次使用Foli-seq进行监测。结果发现，在 D. newyorkensis 成功定植后，那些在网络图中被预测与它相关的宿主炎症基因，如 S100a9, Tnf, Il1b 和 Clec4d，其表达水平均出现了显著上调。

这个实验有力地证明了，通过Foli-seq和微生物组测序的结合，我们不仅能描绘出宿主与微生物互作的“地图”，还能基于这张地图进行预测，并通过实验加以验证。这为理解微生物如何影响宿主健康、宿主如何塑造微生物环境这一核心科学问题，提供了一个强大而动态的研究框架。

从实验室到临床：IBD患者分型的新“罗盘”

Foli-seq在小鼠模型中展现的巨大潜力，最终能否转化应用于人类？为了探索其临床应用价值，研究团队与一个大型IBD患者队列研究项目 (SPARC IBD) 合作，获取了123名IBD患者（包括克罗恩病和溃疡性结肠炎）和16名健康人的粪便样本。

尽管这些样本经过了多次冻融，Foli-seq依然表现出了极佳的稳健性，成功地对其中超过84%的样本进行了分析。通过对543个人类基因的表达谱进行PCA分析，研究人员发现，IBD患者可以被清晰地分为四个不同的“脱落组分型” (exfoliome clusters, exC1至exC4)。

这些基于粪便RNA的分子分型，并非流于表面的学术游戏，它们与患者的临床表型密切相关。

临床严重度关联：exC1和exC2分型的患者，其临床症状更轻，更多处于疾病缓解期，与健康对照组更为接近。而exC3和exC4分型的患者，则表现出更严重的中重度疾病活动，并且便急 (fecal urgency) 的症状也更普遍。

免疫细胞图谱差异：通过生物信息学算法对Foli-seq数据进行解卷积 (deconvolution)，可以推断出不同分型中免疫细胞的相对组成。结果显示，不同分型拥有截然不同的“免疫底色”。例如，exC2富含巨噬细胞 (macrophages) 信号，而exC3和exC4则以中性粒细胞 (neutrophils)、活化的肥大细胞 (mast cells) 和滤泡辅助T细胞 (follicular helper T cells) 的信号为主。这为理解不同患者亚群的免疫病理机制提供了重要线索。

关键基因特征：每个分型都有其独特的基因表达特征。例如，与健康组相比，exC3和exC4的患者普遍下调了维持肠道屏障和水平衡的关键基因 AQP8，同时显著上调了包括 S100A9 (钙卫蛋白的亚基)、IL1B 和 OSM 在内的一系列促炎基因。其中，OSM（抑癌蛋白M）已被证明与抗TNF-α治疗的抵抗性有关，提示Foli-seq分型或许还能指导治疗方案的选择。

这项在人类队列中的初步探索，有力地证明了Foli-seq能够无创地将IBD这一高度异质性的疾病，划分为具有不同临床和免疫特征的亚型。这就像为在茫茫大海中航行的临床医生，提供了一个全新的“分子罗盘”，有望引导他们为不同类型的患者制定出更加精准的治疗策略。

“粪”中窥豹：肠道健康监测的下一场革命

Foli-seq技术的出现，如同一把钥匙，打开了“粪便脱落组”这个被长期忽视的信息宝库。它巧妙地绕过了传统方法的种种障碍，让我们第一次能够以如此高的灵敏度和分辨率，无创、纵向地倾听来自肠道宿主细胞的“声音”。

这项技术的核心价值在于其 动态性 和 整合性。它将我们对肠道的认知，从静态的、孤立的快照，带入了动态的、连续的、整合的电影时代。我们不再仅仅满足于知道肠道里“有哪些微生物居民”，而是能够实时了解“宿主与居民之间正在发生怎样的对话”，以及“这场对话如何随着时间、疾病和治疗而演变”。

从在小鼠模型中追踪炎症的全程、评估药物的靶向效果、预测疾病的严重程度，到揭示宿主与微生物的互作网络，再到对IBD患者进行精准的分子分型，Foli-seq在多个层面展现了其作为下一代肠道健康监测工具的巨大潜力。

当然，这项技术仍处于早期阶段，更大规模、更长周期的临床研究正在等待着我们。但我们可以合理地畅想，在不远的未来，IBD患者或许不再需要频繁地接受痛苦的肠镜检查，只需定期提供一份粪便样本，医生就能清晰地了解其肠道炎症的活动水平、主要的免疫驱动通路，并判断当前治疗是否有效，甚至预测下一次复发的风险。

Foli-seq的故事，是一个典型的科学创新故事：它源于一个长期存在却难以解决的临床需求，通过巧妙的思路和技术整合，最终将看似无用的“废物”转化为了蕴藏无限价值的“黄金”。它提醒我们，在我们身体最不起眼的角落，或许正隐藏着解答最复杂生命谜题的关键线索。而科学的魅力，就在于赋予我们不断探索这些未知角落的全新视野和工具。