Signal Transduct Target Ther | 四川大学林云锋/田陶然等合作开发新的方法，进行高通量全身免疫监测

全身免疫监测是早期诊断免疫功能障碍不可缺少的工具，同时促进了治疗结果的实时评估。此外，它对感染控制、疫苗研制、器官移植和免疫治疗至关重要。因此，免疫监测已被广泛确认为免疫状态的基本保健评价方法基于流式细胞术的细胞表型是常规免疫监测的主要方法。然而，作为一种一对一的测量，流式细胞术的广泛应用，特别是在健康筛查和资源不足地区，由于其技术敏感、高成本和耗时的性质而受到阻碍。此外，由于抗体与免疫标记物变体的非特异性结合，流式细胞术在免疫细胞表型分析中的准确性可能会受到损害为了提高仪器在流体和光学模块方面的性能，已经做了一些努力。然而，缺乏智能和敏感的检测平台仍然是发展高通量免疫细胞表型生物测定的主要障碍，因为基于抗体的标记技术限制了其可扩展性。

杂化链反应(HCR)是构建高性能、通用的检测平台的潜在策略。作为一种无酶的DNA自组装反应，HCR在外界刺激下形成广泛的DNA双链。许多研究人员设计了基于HCR的适体感应策略，通过将适体引入毛状适体探针的脚端和茎区来检测细胞膜蛋白。但检测时间长(>2 h)，灵敏度低，操作繁琐(靶细胞分离)，不能满足临床需求。Wang等人设计了结构转换适体探针来识别膜蛋白并触发两个HCR探针的杂交。但检测时间较长，个别病例检测时间达4 h，70 min后细胞内对探针的摄取变得明显，可增加非特异性荧光信号此外，Chen等人设计了适体识别促进杂交链式反应体系，包括一个适体探针和两个HCR探针;但检测时间为2h。

HCR探针在临床样品检测中的细胞表型研究遇到瓶颈，主要有两个原因：首先，适配体和互补链之间的高解离障碍会损害发夹结构适配体探针的结构转换动力学人们发现活性结构域的可及性在转换动力学中起着至关重要的作用。当互补链锁定活性结构域时，很少观察到解离。然而，由于有限的蛋白质-核酸相互作用分析，确定大多数适体的活性结构域仍然具有挑战性。其次，由于溶液中的随机碰撞以及细胞膜和发夹之间的带电斥力，发夹1和发夹2之间的反应通常是缓慢的，这妨碍了检测的灵敏度。研究人员试图将HCR探针固定在金纳米颗粒和氧化石墨烯表面，以提高局部探针浓度。然而，在这些支架上实现对探针可寻址性、密度和方向的精确控制仍然具有挑战性。

基于DSAP的高通量免疫监测示意图（Credit: Signal Transduction and Targeted Therapy）

该工作提出了一种基于 post-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)适体优化和DNA四面体框架(DTF)结构HCR探针设计的DNA框架信号扩增平台(DSAP)构建策略。首先，基于后SELEX优化分离活性结构域，并将部分活性结构域与粘端(H1-SE)一起加载到hairpin1的脚端区域，加速了它们与靶蛋白结合时与互补链的分离。此外，DTF因其一锅式组装、设计简单、产率高等特点而受到越来越多的关注。DTF被用作探针的支架，可以在纳米尺度上实现精确的空间定向和距离控制DTF的空间约束使发夹局部浓度提高了578倍，灵敏度提高了40倍。

基于普遍适用的DSAP，该研究开发了一种高通量免疫细胞表型系统，通过定量分析免疫细胞，CD4+ T, CD8+ T淋巴细胞和单核细胞。DSAP将临床血液样本免疫细胞表型化所需的时间缩短至30分钟，无需细胞洗涤和人工亚群分析。使用DSAP获得的结果与使用常规流式细胞术获得的结果高度一致。作为一种概念验证，DSAP在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染分期和癌症治疗中的免疫监测方面表现出很高的准确性。因此，该研究提出的DSAP是一种有希望的快速临床免疫监测方法，并促进便携式护理点设备的研究。