《科学·进展》：北大团队从中药野马追中分离到治疗神经退行性疾病的天然分子！

近些年来，神经退行性疾病如帕金森病和阿尔茨海默症等，引起了社会的关注。由于人口结构老龄化，神经退行性疾病的发病率越来越高，但与此同时，与之相关的药物研发并没有突破性进展，十分曲折。因此，发现新的治疗神经退行性疾病的药物靶点显得至关重要。

炎症反应是免疫系统面对感染和损伤时的一种防御机制，中枢神经系统也不例外。在面对各种感染、脑损伤或毒素等信号时，神经系统中的免疫细胞，如小胶质细胞等就会被激活，产生一系列神经性炎症。正常的神经炎症反应可以修复损伤组织，对神经系统起到保护作用；而异常的神经炎症反应，则与神经退行性疾病的发生和进展有很大的关联。通常，与神经退化相关的异常神经炎症是由小胶质细胞的激活引发的，如此看来，从抑制小胶质细胞的激活来下手，可能有利于神经退行性疾病的治疗。

这次，北大的屠鹏飞/曾克武团队就在中药材中挖到了宝。

屠鹏飞/曾克武团队发现，从中药野马追分离出的天然小分子，野马追内酯B（EB），可以通过去泛素化酶USP7来抑制小胶质细胞的激活，从而达到抗神经炎症的作用。这项研究首次揭示了去泛素化酶USP7是潜在的治疗神经退行性疾病的药物新靶点，为神经退行性疾病的药物研发提供了理论基础。文章于近期发表于Science Advances上 [1]。

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野马追是一种常见的用于治疗慢性支气管炎的中药材，而野马追内酯B（EB）是从中分离出来的半萜类化合物。

Figure 1. 野马追内酯B

在这项研究中，研究人员首先通过高通量筛选发现，EB可以通过下调一氧化氮（NO）、白介素-6（IL-6）以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症介质来抑制BV-2小胶质细胞。

为确定其机理，他们合成了生物素-野马追内酯B（Bio-EB），并应用该探针初步证实了去泛素化酶USP7是EB的靶标蛋白。为了检测EB与USP7结合的特异性，他们使用表面等离子共振（SPR），测出EB和USP7的解离常数为6.85 µM，在34个去泛素化酶（USPs）家族蛋白中，EB能够特异性结合USP7。

泛素化是广泛存在于自然界中的翻译后修饰，被泛素标记的蛋白会被细胞降解。与此同时， USPs也可以逆转泛素化的过程，去除泛素化修饰。其中，USP7是一个存在于所有真核细胞中的去泛素化酶。目前关于USP7与小胶质细胞介导的神经性炎症关联的研究还不是很多。

在这里，为验证小胶质细胞被抑制是由于EB与USP7的结合，研究人员使用siRNA技术干扰了USP7的表达，在USP7被抑制表达的小胶质细胞中，由EB引起的一系列炎症介质的下调均被逆转。

Figure 2. siRNA干扰USP7表达后，EB介导的炎症因子下调均被逆转

以上一系列实验证明，EB与USP7特异性结合，从而抑制小胶质细胞介导的炎症反应。

接下来，研究者利用SRP实验、蛋白结构重构解析、荧光共振能量转移实验（FRET）等技术，对EB和USP7的结合模式与位点进行深入探索。

结果发现，EB是通过与USP7的非催化位点HUBL结构域结合，以达到对USP7的别构抑制。在静息状态下USP7处于一种开放式构象，从而达到自我抑制的作用，而泛素化底物的结合则会引导其形成关闭式构象以发挥催化作用。EB的插入会诱导USP7形成一种过度开放的构象，从而抑制其发挥去泛素化作用。这种新的作用模式在之前并未被报道过。并且研究者进一步证明，USP7的Cys576是EB抑制小胶质细胞、发挥抗炎作用的关键位点。

Figure 3. USP7的关闭、开放和过度开放构象

那么，USP7又是如何与小胶质细胞挂上勾的呢？要知道，USP7能够作用于多种泛素化体物，能够激活小胶质细胞的究竟是哪种蛋白底物呢 ？

借助稳定同位素标记（SILAC）和定量蛋白组学分析，能够对EB产生响应的蛋白底物Kelch-like ECH-associated protein 1 （Keap1）成功引起了研究者们的注意，而且Keap1已被证明在炎症反应中发挥着重要作用。

进一步研究表明，EB通过抑制USP7的去泛素化，加快其蛋白底物Keap1的降解，从而调节Keap1/Nrf2信号通路来抑制炎症反应。同时还揭示了USP7和Keap1的结合区域，不过值得注意的是，EB并不直接结合于Keap1。

了解到这些之后，轮到小鼠出场了。

在开始小鼠体内实验之前，研究人员测试了EB的药代动力学特性。通过测量胃内给药0.25~3小时之后的血浆和脑内的EB浓度，他们得出结论，EB具有良好的口服生物利用度，能够透过血脑屏障达到其治疗浓度。

随后他们开始了EB的体内实验。他们构建了带有一个Usp7无效等位基因的老鼠模型(Usp7+/−)，以检测EB是否影响小胶质细胞的标志物Iba-1和CD68的表达。

结果显示，在Usp7WT小鼠模型中，由细菌脂多糖刺激产生的Iba-1和CD68表达均被EB所抑制，并且EB能够更有效地减少分枝点，保护小胶质细胞的形态，减少促炎因子如TNF-α 和 IL-6的产生，具有显著的神经保护作用。以上现象在Usp7+/−小鼠中均未被发现。

Figure 5. Usp7WT和Usp7+/−小鼠模型中Iba-1, CD68, TNF-α, IL-6, 和MAP2 IHC染色随EB浓度变化

不仅如此，他们还在Nfr7WT和Nfr-/-小鼠模型实验中再次证明，EB通过调节USP7-Keap1/Nrf2通路，来抑制小胶质细胞的激活，发挥抗神经炎症作用。

最后，研究人员探索了EB治疗神经退行性疾病的可能性。

他们使用遗传性快速老化促进小鼠模型（SAMP8）来模拟衰老相关的痴呆症状，并进行水迷宫实验。

结果发现，使用EB治疗的SAMP8小鼠模型，在第5天记忆力就有了显著的提升，大脑皮质和海马体中由于衰老减少的尼氏体在EB的作用下也显著增加。与其对照品系SAM抗性小鼠（SAMR1）相比，未使用EB治疗时SAMP8小鼠脑中Iba-1和CD68更多，但是使用EB之后，这些标志物明显下降。而且EB能够更有效地减少小胶质细胞的分枝点，保护小胶质细胞的形态，减少TNF-α和IL-6的产生，提高了NQO1和HO-1的表达，具有显著的神经保护作用。

Figure 6. 左：水迷宫实验；右：Iba-1 SAM小鼠大脑皮质IHC染色和尼氏染色

随后，他们在帕金森小鼠模型中也证明了EB的神经保护作用和对神经性疾病的逆转效果。

本项研究首次揭示了USP7与神经退行性疾病的联系，并发现其非催化域HUBL是一个潜在的药物研发的靶点。野马追内酯B作为首个靶向于USP7非催化域的小分子抑制剂，为之后开发更多USP7抑制剂提供了思路，也为神经退行性疾病的药物研发提供了理论基础。