《自然·医学》：扑朔迷离！迄今最大规模研究破解持久性CAR-T细胞转录组特征

CAR-T细胞疗法的诞生，改变了很多白血病患儿的命运。

然而，CAR-T细胞治疗的效果难以预测。有些患儿治疗后病情长期缓解，甚至实现了临床治愈；更多的患儿却因为CAR-T细胞消失等原因，癌症很快就卷土重来。

虽然已经有研究发现，CAR-T细胞的持久性与治疗效果密切相关[1]，但是科学家和医生对能持续存在的CAR-T细胞的特征知之甚少。

去年年初，宾夕法尼亚大学Carl H. June团队分析了两名缓解超过十年的慢性淋巴细胞白血病（CLL）成人患者的CAR-T细胞，发现最后持续存在的居然是一群具有细胞毒性的CD4+CAR-T细胞[2]。不过，这个研究样本量较小，其他类型患者是否存在类似情况仍未可知。

近日，由英国伦敦大学学院大奥蒙德街儿童医院Sara Ghorashian和桑格研究所Sam Behjati领衔的研究团队，在著名期刊《自然·医学》发表了迄今为止最大规模的持久性CAR-T细胞研究[3]，进一步揭示了接受CAR-T治疗后获得持续缓解的患者的CAR-T细胞特征。

值得注意的是，在这一次的研究中，研究人员发现的持久性CAR-T细胞不是CD4阳性的，而是CD4/CD8双阴性的，这一结论与June团队的不同，凸显了持久性CAR-T的复杂性。不过，让人欣喜的是，两个团队在持久性CAR-T细胞中发现了类似的转录特征，这一发现或许给研究持久性CAR-T细胞的科学家们留了一扇窗。

论文首页截图

接下来，咱们就一起来看看Ghorashian团队的研究是如何展开的，以及他们发现了什么。

为了进一步了解持久性CAR-T细胞的特征，Ghorashian团队使用的是参加了CARPALL试验的10名R/R B-ALL患儿的CD19 CAR-T细胞样本。CARPALL研究一开始招募了15名患儿，其中13名患儿实现了完全缓解；这些完全缓解的患儿中有6名随后复发，另外7名被证实实现了长期缓解。

他们从其中10名患儿的血液样本中获得了足够的CAR-T细胞，并根据采样距离回输CAR-T细胞的时间，将样本分为早期（1-3个月，实现完全缓解的时间窗口），中期（4-6个月）和晚期（7-60个月，复发的时间窗口）。然后通过流式细胞仪利用CD3和CAR表达从外周血或骨髓中分离出CAR-T细胞。

患者的疾病情况和研究流程

Ghorashian团队总共采集了264827个通过质量控制的单细胞，其中约50000个是CAR-T细胞。在分析所有CAR-T细胞表面的标志物之后，他们发现，在大多数情况下，CD8+T细胞都是主要CAR-T细胞；不过，在晚期这个时间点，CAR-T细胞缺乏CD4和CD8A转录物的表达。

值得注意的是，在所有时间点上，CD4+CAR-T细胞的占比都很小。汇总来看，那些持续存在的CAR-T细胞主要是CD4/CD8双阴性T细胞。这一发现与June团队的截然相反（CD4+CAR-T细胞多，双阴性T细胞少）[2]。

为了证实上述发现，Ghorashian团队又获取了7名获得持续缓解患儿的外周血（PB）和骨髓（BM）样本，这些样本是在晚期时间点收集的（输液后7-72个月）。

他们分离并分析这些CAR-T细胞，证实晚期时间点上大多数细胞是双阴性的。相较而言，在这些患儿的非CAR-T细胞中，双阴性T细胞比例较低。此外，他们还发现这些持久存在的CAR-T细胞还表现出缺乏CD45RA和CCR7的表达，这表明它们具有效应记忆表型。

基于以上研究数据，研究人员认为，大多数持续存在的CAR-T细胞是双阴性的αβ T细胞。

不同T动态变化

接下来的问题是，不同患者体内的持久性CD4-CD8-CAR-T细胞在转录层面究竟有没有相似之处，以及与其他时间段的CAR-T细胞有没有区别呢？

还真有。

Ghorashian团队用单细胞测序技术，分析了早期、中期和晚期CAR-T细胞，以及输注前的CAR-T细胞的转录组数据，结果发现差异很大，而且晚期持久存在的CAR-T细胞表现出一种相同的转录组特征。

转录组特征

具体到晚期的持久性CAR-T细胞而言，它们高表达免疫相关基因，如TIGIT和GPR183，以及在免疫生物学中具有未知或新兴作用的基因，例如FXYD2、HMOX1、DENND2D和ISG20。

T细胞耗竭标志物TIGIT的出现，吸引了Ghorashian团队的注意。进一步分析发现，持久性CAR-T细胞确实表达了一些典型的共抑制受体，如HAVCR2和LAG3；PDCD1的表达也小幅上升。此外，与前体耗竭的T细胞（与免疫治疗疗效有关）类似，晚期CAR-T细胞也有相关效应基因（GZMK和PRF1），以及与T细胞耗竭相关转录因子（TOX、NFATC1、BATF和PRDM1等）的表达。

持久性CAR-T细胞虽然表现出耗竭的特征，但并没有表现出终末分化的特征。此外，持久性CAR-T细胞中JUN的表达很强，JUN可以介导T细胞衰竭的逆转，以及维持那些具有干细胞记忆特性的细胞。基于以上结果，研究人员认为，持久性CAR-T细胞具有耗竭样记忆状态和独特的转录特征。

不同时期CAR-T细胞的转录特征

至于这些持久性CAR-T细胞是不是源于克隆扩增，Ghorashian团队的研究结果表明，这种功能上的趋同，并不是克隆扩增导致的，因为在所有的时间点上，CAR-T细胞群在遗传上是多样化的，而且没有证据表明存在一个或多个克隆在晚期的时间点上占主导地位。

尤其值得注意的是，Ghorashian团队将这种转录特征与June团队的数据做了比对，对比结果出人意料，虽然这两个研究发现的持久性T细胞存在很大差异（一个是双阴性的，一个是CD4阳性），但是这两个研究的持久性CAR-T细胞的转录特征却高度相似。

这种相似性让Ghorashian团队怀疑起了这个转录特征的普遍性，不过在对来自各种健康组织的T细胞、迄今为止的其他CAR-T研究和癌症细胞单细胞图谱进行了评分之后，他们打消了这个疑虑，因为没有找到持久性CAR-T细胞的这种转录特征。也就是说，这个转录特征是持久性CAR-T细胞所特有的。

不同T细胞的转录特征

总的来说，Ghorashian团队认为，他们这个研究最重要的发现是发现了持久性CAR-T细胞的独特转录特征。而且这个特征在不同人群、不同CAR-T疗法中也存在。因此这暗示着，这种独特的转录特征有可能代表了持久性T细胞的通用特征。

未来，本研究发现的转录组变化值得展开进一步的探索。如果能取得突破，或许有助于科学家破解持久性CAR-T的谜题，找到让CAR-T细胞持续存在的方法，更好地治疗各种癌症。

参考文献：

[1].Finney OC, Brakke HM, Rawlings-Rhea S, et al. CD19 CAR T cell product and disease attributes predict leukemia remission durability. J Clin Invest. 2019;129(5):2123-2132. doi:10.1172/JCI125423

[2].Melenhorst JJ, Chen GM, Wang M, et al. Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells. Nature. 2022;602(7897):503-509. doi:10.1038/s41586-021-04390-6

[3].Anderson, N.D., Birch, J., Accogli, T. et al. Transcriptional signatures associated with persisting CD19 CAR-T cells in children with leukemia. Nat Med, 2023. https://doi.org/10.1038/s41591-023-02415-3