Nature子刊：利用高通量液滴微流控技术对来自接受ART药物治疗的HIV感染者的HIV前病毒及其宿主整合位点进行测序

人类免疫缺陷病毒（HIV）的感染是通过将它的基因组整合到受感染的宿主细胞中，进入可逆的潜伏状态，从而逃避抗逆转录病毒治疗（ART）。在单个细胞中对HIV前病毒（provirus，即病毒基因组整合进宿主细胞DNA的HIV）和相邻的宿主DNA连接（DNA junctions）进行测序的能力可以突出它的作用机制和在受感染细胞中的持久性。然而，由于背景人类DNA的数量高出1.5亿倍，这一实验很难进行。

在一项新的研究中，来自加州大学旧金山分校、华盛顿大学、美国国家卫生研究院和陈-扎克伯格生物中心的研究人员通过高通量微流控分析---对天然环境下的的HIV DNA进行基于液滴的全基因组扩增，展示了全长的HIV前病毒如何连接到HIV-宿主DNA连接。他们进行了PCR反应来标记含有HIV前病毒的液滴，对来自当时正在接受抑制性ART治疗的HIV感染者的受感染细胞进行测序和检测，以检测和测序成对的HIV前病毒基因组和整合位点。这项研究试图改善对持久受到HIV病毒感染的细胞库（下称HIV病毒库）的遗传分析。相关研究结果于2022年3月28日在线发表在Nature Biomedical Engineering期刊上，论文标题为“Droplet-microfluidics-assisted sequencing of HIV proviruses and their integration sites in cells from people on antiretroviral therapy”。

HIV治疗的现状和不断发展的治疗策略

虽然全世界大约有3700万人感染了HIV，但治愈方法仍然是未知的。这种病毒的感染机制构成了一个核心障碍，同时也是治愈该疾病的关键，因为HIV将它的基因组整合到受感染细胞的基因组中。虽然ART可以将病毒复制抑制到检测不到的水平，并防止获得性免疫缺陷综合征（AIDS，俗称艾滋病）的产生，但是它无法抵抗HIV病毒库。因此，ART必须无限期地持续下去，以防止病毒反弹和疾病进展。终生服用ART药物的费用高昂，很难解决与HIV有关的耻辱问题，而且有潜在的毒性。因此，根除或抑制HIV病毒库以获得功能性治愈非常重要。

为了研究HIV病毒库的持久性，科学家们必须对整合位点和全长的HIV前病毒序列进行配对分析。通过建立一种可靠的、具有成本效益的分离和测序稀有的HIV前病毒的方法，这些作者可以全面地描述HIV病毒库的特征。他们开发了这样一种方法，即利用同步整合位点和前病毒测序（simultaneous integration site and provirus sequencing, SIP-Seq）来描述HIV病毒库中的HIV前病毒及其细胞基因组背景。

战胜困难：一种获得单个HIV原病毒基因组的方法

通过使用全基因组测序扩增，这些作者在天然环境中扩增微流控液滴内的HIV基因组，然后对含有HIV前病毒的液滴进行标记以便进行测序。由此产生的方法提供了通过单个连续装配与它的宿主细胞DNA连接组装在一起的全长HIV病毒基因组。该方法的速度和效率允许在高出1.5亿倍的DNA背景中获得单个HIV前病毒基因组。他们使用SIP-Seq对多个ART相关个体的HIV前病毒群体进行分析，以了解潜伏的HIV病毒库。虽然他们专注于HIV，但是这种方法适用于入侵宿主基因组的多种病毒，以提供一种通用平台来描述多种感染的遗传学特征。

SIP-seq在接受ART药物治疗的感染者中的应用。图片来自Nature Biomedical Engineering, 2022, doi:10.1038/s41551-022-00864-8。

实验

这些作者旨在从数百万个CD4+T细胞中获得含有HIV基因组的所有DNA片段，对它们进行单独测序，并对它们相邻的宿主DNA连接进行测序。他们从封装在微液滴中的宿主细胞中提取了较大的DNA片段，以分离出整合到宿主细胞DNA中的HIV基因组。利用多重置换扩增（multiplexed displacement amplification, MDA），他们非特异性地扩增每个基因组片段，以获得足够多的HIV前病毒进行测序。他们随后分离出带有HIV前病毒的液滴，对每个液滴进行条码编码和测序。他们接着将每个液滴的读取片段映射到HIV参考基因组上以确定整合位点，从而获得对HIV基因组的复杂性及其整合位点的明确信息--这对评估HIV病毒库至关重要。

用SIP-Seq和调节微流控技术检测HIV前病毒

为了提高全长HIV前病毒的特异性并防止随机DNA裂解，这些作者采用了双特异性多重Taqman PCR来靶向HIV基因组上的区域。在实验过程中，他们产生了特定体积的DNA来进行测序并确认获得HIV前病毒。SIP-Seq装置的微流控技术包含三个设备，包括一个液滴封装器、一个合并器和一个分拣器。他们将多重置换扩增（MDA）试剂与人类基因组DNA片段装载在一起，在15分钟内将多达100亿个DNA片段（长度近似75kbp）封装在2000万个独立的液滴中。每个液滴包含500个不同的片段，在与Taqman PCR试剂合并在一起之前，他们将它们放在试管中在30℃下孵育，进行非特异性扩增。对所有检测到的HIV基因组重复这些步骤后，他们准备对这些试管进行测序。

分析接受ART治疗的感染者的HIV前病毒及其基因组蓝图

这些作者接下来在感染HIV的细胞系上验证了SIP-Seq，并分析了接受ART治疗的感染者体内的HIV。在实验中，他们先是利用平板培养来自接受ART治疗的感染者的静止性CD4+T细胞，在进行刺激和体外培养后通过三种方法进行增殖；鸟枪法、巢式PCR和使用Taqman探针的SIP-Seq。SIP-Seq和巢式PCR都产生了很好的结果，他们特别选择了SIP-Seq来描述体内受感染细胞的全部基因多样性。在此之后，他们表征了直接从感染者的CD4+T细胞中分离出HIV前病毒的基因组特征。这些结果显示，相对于以前对相同个体的研究，有三个克隆谱系支持克隆起源。

展望

这项新的研究表明，与现有的PCR方法相比，这些作者开发的方法使得他们能够更有效地研究HIV前病毒。他们通过表征潜伏的HIV病毒库的特征，对体内的HIV遗传图谱进行了全面的分析，突出了HIV病毒库在HIV持续存在中的作用。现有的方法是具有挑战性的，因为稀缺性和缺乏明确的表面标志物来识别遭受HIV潜伏感染的细胞。他们利用所描述的SIP-Seq方法，提供了一种快速、经济和可扩展的过程，他们将它应用于接受ART治疗的感染者，以突出潜伏的HIV病毒库中存在的克隆扩增细胞（clonally expanded cells）。这一策略适用于所有HIV感染，也适用于其他在生命周期中具有整合状态的病毒性疾病。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

1. Chen Sun et al. Droplet-microfluidics-assisted sequencing of HIV proviruses and their integration sites in cells from people on antiretroviral therapy. Nature Biomedical Engineering, 2022, doi:10.1038/s41551-022-00864-8.

2. Sequencing HIV proviruses from people on antiretroviral therapy using droplet-microfluidics
https://medicalxpress.com/news/2022-04-sequencing-hiv-proviruses-people-antiretroviral.html