Nature Methods | 提高生物大分子成像分辨率：电喷雾技术在cryo-EM中的突破

该研究首次详细阐述了通过电喷雾辅助的低温电子显微镜（Electrospray-assisted cryo-electron microscopy）技术来优化蛋白质样本制备的过程。通过调整样本流速、喷雾电压和蛋白质浓度，有效地维持了蛋白质的原始结构和功能状态，这在传统方法中是难以实现的。

研究团队进行了系统的参数优化实验，找出了最佳的样本流速、喷雾电压和蛋白质浓度，这些参数的优化对保持蛋白质的结构完整性至关重要。此外，使用低导电性金属材料在纳米电喷雾（nano-ESI）中也显著改善了样本的结构保存。

通过优化的参数设置，研究显示样本在低温电子显微镜下的结构完整性得到显著提高。这为使用cryo-EM技术进行高分辨率蛋白质结构分析提供了强有力的方法学支持。

该技术的成功应用，不仅提高了cryo-EM技术的实用性和效率，还为未来在更多生物大分子结构研究中的广泛应用打下了基础。特别是在药物设计和疾病机理研究等领域，将大有裨益。

该研究围绕优化低温电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）样本制备过程中的电喷雾（Electrospray, ESI）参数，以减少样本制备时界面效应对蛋白质结构完整性的负面影响。研究通过调节样本流速、喷雾电压、蛋白质浓度及喷射距离等参数，探索其对样本结构保持的影响。利用结构保持良好的蛋白质模型，如APO-铁蛋白（apo-ferritin）和血管紧张素转换酶2（ACE2），进行实验验证，确保获得的数据具有普遍性和可重复性。

样本准备

研究使用纯化的APO-铁蛋白和ACE2作为测试蛋白。这些蛋白先通过常规方法纯化，然后稀释到不同浓度，准备用于电喷雾。

电喷雾参数优化

样本流速：研究中测试了从几微升到几十微升每分钟的不同流速，观察不同流速对蛋白质样本的影响。

喷雾电压：调节电压从几千伏到几十千伏，分析电压变化如何影响蛋白质的电荷状态和结构完整性。

蛋白质浓度：蛋白质浓度的变化直接影响样本在电喷雾过程中的聚集和分散行为。

喷射距离：即样本从电喷嘴到载物玻片的距离，调整此参数以优化样本着陆前的蒸发和冷却过程。

结构分析

采用低温电子显微技术对处理后的样本进行成像，收集数据，并使用图像处理软件如ChimeraX和PHENIX进行三维结构重建和分析。

数据统计与分析

对实验中获得的大量图像数据进行统计分析，评估不同参数下样本的结构完整性比例。使用负染色电镜（negative staining EM）和native MS对样本的保持情况进行评价。

通过详细的参数调整，研究显示低流速、低电压和高蛋白质浓度条件下，样本的结构保持得最好。这些条件有助于减少蛋白质在空气-液体界面的损伤，从而保持其在冷冻环境下的原始三维结构。此外，低导电性金属材料的使用在纳米电喷雾（nano-ESI）技术中也显示了显著的结构保护效果。

低温电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技术

低温电子显微镜（cryo-electron microscopy, 简称cryo-EM）技术是一种先进的电子显微镜技术，用于观察生物大分子的近原子分辨率结构。这种技术对生物学研究尤其重要，因为它允许研究人员在接近自然状态下观察复杂的生物分子，如蛋白质和病毒。

低温电子显微镜的基本流程

样品制备：首先将生物样品分散在支持网格上的液滴中。然后迅速冷冻，通常是使用液氮或液氦，使水分子形成玻璃态而不是晶体。这种快速冷冻过程被称为“急冻”，可以防止冰晶的形成，这对样品结构的保存至关重要。

电子显微镜成像：急冻的样品在低温下（通常是液氮温度，约-196°C）被放入电子显微镜中。高能电子束穿透样品，形成图像。由于样品在极低温度下保持固定，因此可以在几乎没有损伤的情况下进行高分辨率成像。

图像处理和三维重建：收集成千上万个二维投影图像，通过复杂的算法处理这些图像以重建出生物大分子的三维结构。这包括使用各种计算方法对图像进行对齐、分类和平均，以提高信噪比和分辨率。

模型构建和验证：在获得高分辨率的三维密度图后，可以在其中拟合原子模型，并进行进一步的分析和验证，以确保模型的准确性。

技术发展

1975年：急冻样品制备的引入

Jacques Dubochet 和同事们开发了急冻水样品的方法，这是cryo-EM技术的基础。这种方法通过快速冷冻样品来避免冰晶形成，从而在电子显微镜下保留了生物样品的原生状态。

1984年：第一个急冻电镜图像的获取

Alasdair McDowall等人使用急冻技术获得了首个无冰结构的电镜图像，这标志着cryo-EM在生物样品成像中的一个重要突破。

1990年代：自动数据收集和图像处理软件的发展

随着计算机技术和图像处理算法的进步，自动化数据收集和高级图像重建方法的开发，使得从成千上万的二维图像中重建复杂三维结构变得可能。

2012年：直接电子探测器（Direct Electron Detectors）的引入

这类探测器的出现显著提高了图像的信噪比和时间分辨率，允许研究人员获得更清晰和更高分辨率的图像。这一进步极大地推动了cryo-EM技术的应用，使其能够解析接近原子水平的结构。

2013年和2015年：分辨率革命

在这两年中，多个研究组报道了使用cryo-EM解析达到原子级分辨率的生物大分子结构。这被广泛认为是cryo-EM领域的一个转折点，此后，该技术成为了结构生物学中的一个强大工具。

2017年：诺贝尔化学奖

Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson因为他们在发展cryo-EM技术，尤其是在高分辨率结构确定方面的贡献，共同获得了诺贝尔化学奖。

应用领域

低温电子显微镜（cryo-EM）技术的应用非常广泛，尤其在生物学和医药领域，它为了解复杂生物分子的结构和功能提供了强大的工具。主要应用领域包括：

蛋白质结构解析

Cryo-EM 在蛋白质结构生物学中的应用非常广泛，尤其适用于那些难以通过X射线晶体学或核磁共振（NMR）技术解析结构的大分子和复杂体。它可以揭示蛋白质的三维结构，帮助研究人员理解其功能和生物化学性质。

病毒学研究

在病毒学领域，cryo-EM 能够详细描绘出病毒颗粒的结构，包括其表面蛋白和遗传物质的排列。这对于研究病毒如何感染宿主细胞以及如何设计有效的疫苗和抗病毒药物至关重要。

药物设计

通过解析药物分子与其靶标（如蛋白质或其他生物大分子）的复合物结构，cryo-EM 可以帮助科学家设计更为精确的药物分子，提高药物的效力和选择性。

生物大分子复合物

Cryo-EM 特别适合研究多个蛋白质或核酸以及其它分子组成的大型复合物。这些大分子机器往往在细胞中承担关键功能，如核糖体、膜蛋白复合体、分子马达等。

动态结构分析

除了静态结构外，cryo-EM 还能够捕捉生物分子在不同功能状态下的结构变化。这对于理解生物分子如何通过其结构变化来执行生物功能具有重要意义。

纳米技术和材料科学

虽然主要应用于生物学领域，cryo-EM 也被用于纳米技术和材料科学，例如在研究纳米颗粒和其他复杂材料的组装和结构时。 

样本制备过程中的难点

在低温电子显微镜（cryo-EM）技术中，样品制备是一个关键步骤，也是挑战性极大的环节，因为它直接影响到最终图像的质量和可解析度。样品制备中常见的难点包括：

样品浓度和纯度

样品必须具有足够的纯度和适当的浓度。杂质和污染物可以干扰图像质量，而浓度过高或过低都会影响样品在支持网格上的分布和最终的数据质量。

急冻技术

急冻是cryo-EM的核心，需要迅速将样品冷冻至液氮温度以下，以避免冰晶形成。冰晶的存在会干扰电子束，影响图像的解析度。实现理想的急冻条件需要精确控制样品的温度和冷冻速率。

样品在支持膜上的均匀分布

样品在支持网格上的分布需要均匀，且厚度适中。不均匀或聚集的样品会导致数据收集不一致，从而影响最终的三维重构质量。

脱水保护

在冷冻过程中，水分子在没有形成冰晶的情况下固化成非晶形的“玻璃态”是理想的。这要求在极短的时间内完成样品从液态到固态的过渡，任何操作上的瑕疵都可能导致样品损坏或结构失真。

电镜网格的处理和选择

支持网格的质量和处理方式也对样品制备至关重要。网格需要被恰当地清洁和处理（如胶体膜的涂覆），以确保样品可以均匀分布且附着力足。

样品的稳定性和敏感性

生物样品可能对环境条件敏感，包括温度、pH值和电子束的照射。这要求在样品制备和电镜操作过程中严格控制实验条件。

重复性和可靠性

确保重复的样品制备过程中质量的一致性是一个挑战，特别是对于具有复杂结构的生物大分子。

技术和经验要求

高质量的样品制备需要精湛的技术和丰富的经验。实验室条件、设备和操作者的技能都会对样品制备的结果产生重大影响。

液体电喷雾（Electrospray Ionization, ESI）

液体电喷雾（Electrospray Ionization, ESI）技术在低温电子显微镜（cryo-EM）中的应用主要涉及到一种特定的样品制备方法，称为电喷雾冷冻（Electrospray Freezing）。这种方法将传统的电喷雾技术与低温电子显微镜结合起来，以提高样品制备的效率和样品的质量。

电喷雾离子化（ESI）最初是一种用于质谱（Mass Spectrometry, MS）的样品离子化技术。它通过向液体样品施加高电压，形成带电的液滴，然后通过溶剂的蒸发产生带电的分子或分子团。这个过程使得大分子（如蛋白质、核酸等）能够在气相中进行质量分析。

电喷雾冷冻在Cryo-EM中的应用

在cryo-EM中，电喷雾技术被用来制备生物样品。使用电喷雾冷冻的方法，液体样品在通过一个带电的喷嘴喷出形成细小的液滴时，可以迅速冷冻。这个过程中，样品液滴被直接喷射到液氮或其他冷却剂中，从而瞬间冷冻，形成非晶态的冰，这有助于保持样品的原生状态和结构。

优势

快速样品处理：电喷雾可以迅速生成大量的样品液滴，适合高通量的样品制备。

最小化样品量：这种技术可以使用非常少量的样品进行制备，非常适合珍贵或难以获得的样品。

减少样品聚集：通过电喷雾，样品在冷冻前已经是细小的液滴，这有助于减少样品在冷冻过程中的聚集现象。

挑战

设备和操作的复杂性：电喷雾冷冻需要特殊的设备和精细的操作技术。

样品的稳定性和均一性：确保喷雾生成的液滴大小和样品浓度的一致性是一项挑战。

冷冻快速性和效率：必须确保样品液滴能迅速且有效地冷冻，避免冰晶形成。

电喷雾过程中的荷电水滴

传统研究认为，最终的库仑破裂（Coulomb fission）事件中生成的荷电水滴将比大分子稍大，并在最后的溶剂蒸发过程中，所有的滴子电荷将转移到大分子表面。然而，该研究提出在他们的实验设置中，含有大分子的滴子并没有完全蒸发成气相，因此这些分子大部分仍然浸没在液体中，与气态离子状态相比，质子化（protonation）程度较低。

荷电水滴的库仑破裂与大分子的关系

在电喷雾过程中，液体样本通过喷嘴在高电压的作用下形成带电的微小水滴。当这些水滴通过空气中飞行时，表面电荷积累到一定程度会超过表面张力，导致库仑破裂，形成更小的水滴。传统观点认为，这些更小的水滴中的溶剂会在接近检测器的途中蒸发，最终只留下带电的大分子。这一过程中，所有滴子电荷被认为会转移到大分子表面，这对大分子的空间结构可能造成改变，因为电荷重新分布会影响其三维构型。

这一发现对于改进电喷雾质谱技术具有重要意义。通过控制水滴的蒸发程度和质子化水平，可以更精确地保持样本的原生状态，从而提高结构分析的准确性和可靠性。此外，这也为解决传统ESI-MS在处理大分子样本时可能遇到的问题提供了新的思路，如如何减少样本处理过程中的结构扰动。

高分辨率结构的保持

在ESI过程中，样品溶液被通过带电的喷嘴喷出，形成微小的带电滴子。在飞行至检测器的过程中，这些滴子会经历溶剂的蒸发，使得滴子中的溶质（如蛋白质大分子）逐渐浓缩并最终以带电形式存在。在这一过程中，蛋白质的质子化程度——即蛋白质分子表面质子的数量——将直接影响其三维结构的保持。

质子化通常与蛋白质分子的结构稳定性和功能活性有关。质子化过度可能导致蛋白质分子结构发生变形，从而影响其生物活性。因此，如何在ESI过程中控制质子化程度，以保持蛋白质的原生状态，是提高分析质量的关键。

研究中通过控制ESI的各种参数（如喷嘴电压、流速、滴子的蒸发速度等），实现了对质子化程度的精细调控。特别地，实验结果表明，在较低的质子化条件下，即使是在极端环境（如高电场和低压环境）中，大分子如蛋白质也能保持其原生结构的完整性。这为使用ESI技术进行蛋白质和其他大分子的高分辨率结构分析提供了强有力的实验支持。

这一研究不仅优化了ESI技术中的样品制备和处理过程，也为高分辨率的生物大分子结构分析提供了新的方法论。通过保持大分子的高分辨率原生结构，ESI技术的应用前景将进一步扩展到结构生物学、药物设计、蛋白质工程等多个领域。

电化学反应模型

该研究中提出了一个假设性模型来解释不同条件下的电化学反应及其对蛋白质结构的影响。研究讨论了电静力（electrostatic forces）和动能转化为表面势能生成的冰层及其厚度梯度，这对于容纳不同大小的蛋白质复合体是有利的。

在ESI过程中，液体样本在高电压的作用下被喷射成带电的微小滴子。这些滴子在飞行到质谱仪检测器的过程中会发生快速的溶剂蒸发，导致滴子内部的溶质（如蛋白质）浓度逐渐增高。在这一过程中，滴子内部的电荷重新分布，并产生强烈的电静力。这些力量可以导致蛋白质分子内部或表面的结构发生变化，从而影响其最终的检测和分析结果。

此外，研究中提到的电化学反应模型还考虑了动能到表面势能的转化。这种能量转化能够在微滴表面形成一层具有特定厚度梯度的冰层。冰层的形成不仅有助于减少蛋白质分子表面的直接暴露于环境中，而且可以提供一个相对稳定的微环境，帮助维持蛋白质复合体的结构完整性。

模型的应用及其对蛋白质结构的影响

电化学反应模型提供了一种方法，通过调控电喷雾过程中的电场强度和喷雾参数（如流速、电压等），以优化冰层的形成和厚度梯度。这种方法特别适用于处理那些结构复杂或容易受到环境影响的大分子，如蛋白质复合体。

通过这种模型，可以更精确地控制蛋白质在样本制备过程中的空间排列和结构稳定性。例如，通过调整电喷雾参数来优化冰层的形成，可以有效地“固定”蛋白质复合体在特定的空间构型中，从而在质谱分析中获得更为准确和真实的结构信息。

这种电化学反应模型的应用不仅增强了我们对ESI技术中电荷动态和能量转化机制的理解，也为蛋白质等大分子的高分辨率结构分析提供了新的技术手段。这对于未来在药物开发、生物技术以及相关领域中，对蛋白质复合体的结构和功能进行更深入研究具有重要的科学和实际意义。

改善的角度投影覆盖

对五种大分子样本的欧拉角（Euler angle）分布表明，在傅立叶空间（Fourier space）中显著改善了角度投影覆盖，这对于高分辨率三维重建是至关重要的。

欧拉角分布

在低温电子显微镜技术中，欧拉角是描述样本在三维空间中方向的三个角度——俯仰角（pitch）、偏航角（yaw）和翻滚角（roll）。在进行大分子样本的三维重建时，不同方向的二维投影图像将被合成来重建出完整的三维结构。欧拉角的分布决定了这些投影的方向多样性和全面性，进而直接影响到最终三维结构的分辨率和精确性。

角度投影覆盖的改善

在传统的cryo-EM采样中，由于样本在载物玻片上的随机排列和固定，可能导致某些方向的数据缺失或覆盖不足，称为方向偏好（preferential orientation）。这种偏好会导致三维重建中存在盲区，从而降低结构的解析度和可靠性。通过优化电喷雾过程和样本制备参数，可以显著改善样本的角度投影覆盖。具体来说，可以通过调节样本喷射的速度、角度和溶剂蒸发速度，来控制样本在载物玻片上的分布和定向。

高分辨率三维重建的科学意义

通过改善欧拉角的分布，研究人员能够获取更均匀和全面的数据集，这意味着在傅立叶空间（Fourier space）中，各个角度的数据都能得到充分采样。这种全面的数据采集为重建出无歧义和高精度的三维结构提供了可能，尤其是在解析蛋白质复合体等生物大分子的动态结构和相互作用时，能够提供更为精确的结构信息。

通过使用先进的电喷雾技术和优化的cryo-EM样本制备方法，研究者能够有效控制样本的质子化程度和电荷分布，从而影响其在载物玻片上的定向和分布。此外，采用高级的图像处理算法和数据分析技术，如使用多变量统计分析和机器学习方法来优化角度分布和图像重建过程，也是实现高分辨率三维结构重建的关键。

所以，通过改善欧拉角的分布和角度投影覆盖，不仅可以提升cryo-EM技术的结构解析能力，还可以推动对复杂生物分子系统更深入的理解，对于生物医学研究和相关领域具有重大的科学和应用价值。

潜在的局限性

纳米电喷雾技术（nano-ESI）的挑战

在实施纳米电喷雾辅助的低温电子显微镜（cryo-EM）样本制备时，研究中指出纳米电喷雾（nano-ESI）面临着由于电化学效应而引起的颗粒分离和潜在的薄液膜蒸发问题。这些问题可能会影响样本的质量和完整性，从而限制了该技术在某些情况下的应用。

高分辨率三维结构重建的复杂性

尽管电喷雾辅助的cryo-EM技术可以改善样本的处理和三维结构的重建，但从高分辨率的微观图像获取准确数据仍然是一个技术挑战。特别是在处理超薄样本时，保持样本的均匀厚度和避免结构变形需要精确的操作和优化的设备配置。

适用性和普及性

研究中提到，尽管ESI-cryoPrep方法成本较低且维护相对简单，有望在多个实验室和研究机构中推广应用，但其在不同类型蛋白样本中的普遍适用性和效果仍需进一步验证。对于如膜蛋白和微小晶体等特殊蛋白样本的适用性尚未充分探索。

技术参数的优化需求

虽然通过调节喷射条件可以优化样本制备，但精确控制这些参数以适应不同类型的生物大分子仍然是一项挑战。这包括但不限于溶液注射流速、喷雾电压、样本浓度和从喷嘴尖端到网格的着陆距离等，这些都是在实验中需要精细调控的变量。

长期的实验验证和改进

研究表明，尽管采用了电喷雾辅助的cryo-EM样本制备技术带来了一些初步的成功，但这些方法和技术的长期效果和可靠性还需要通过更多的实验和数据分析来进一步验证和改进。

潜在的研究方向

优化纳米电喷雾（nano-ESI）参数

研究显示，纳米电喷雾技术在操作中存在一些挑战，如电化学效应导致的颗粒分离和薄液膜的潜在蒸发。未来的研究可以聚焦于如何优化纳米电喷雾的操作条件，包括电压、流速、溶剂的选择等，以减少这些负面效应。通过精细调控这些参数，可能有助于提高样品在cryo-EM分析中的结构保持。

扩展到不同类型的生物大分子样本

目前的研究主要集中在几种模型蛋白上。未来的研究可以将方法应用于更广泛的生物大分子，如膜蛋白和微小晶体等。这些生物大分子由于其独特的生物学功能和结构特性，对样品制备和结构分析的要求更为严格。探索适用于这些复杂样本的电喷雾辅助cryo-EM技术将是一个重要研究方向。

高分辨率三维结构重建技术的进一步发展

尽管已有技术能够支持高分辨率的结构重建，但如何进一步提高分辨率和重建效率仍然是一个重要的研究领域。未来的研究可以探索结合人工智能和机器学习技术，以自动化和优化数据处理流程，提高分辨率和降低数据处理的时间成本。

深入研究电喷雾过程中的微观物理和化学机制

电喷雾过程中涉及复杂的物理和化学变化，对这些过程的深入理解可以帮助科研人员更好地控制实验条件，优化样本的制备。未来的研究应当聚焦于电喷雾中液滴形成、电荷分配、溶剂蒸发等基本过程的机制研究，以及这些因素如何影响最终cryo-EM图像的质量和分辨率。