Protein & Cell：沈颖团队发现孤独症小鼠小脑功能性投射改变对社交行为的影响

Neuroligin 3是神经核团之间突触连接重要的黏附分子，家系遗传研究中发现其编码基因Nlgn3中的R451C变异与自闭症密切关联。本文研究团队提出自闭症相关基因Nlgn3突变是否导致小脑-前脑神经核团投射异常，以及投射异常是否导致自闭症样行为的核心原因。基于上述科学问题，团队首先采用AAV1-hSyn-Cre-EGFP病毒和Ai9小鼠来分别观察小脑的三个亚核团（即FN, IN和DN）的下游接收核团的情况，通过连续切片，脑图谱配准和针对CN中的起始神经元数量的归一化处理进行投射差异化的分析，发现CN亚核团对间脑和脑干投射存在异质性。

为研究Nlgn3突变对小脑输出的影响，团队通过将Nlgn3^R451C小鼠与 Ai9小鼠杂交，结合AAV1-hSyn-Cre-EGFP顺行跨突触病毒，分析小脑核团对丘脑、中脑和脑干的36个核团的投射。结果发现Nlgn3^R451C小鼠FN对CL、MD 和 VTA投射减弱，对ZI投射增强；IN对VTA 和 PB投射减弱，对ZI投射增强；DN对PB 和 Po投射减弱，同样对ZI投射增强。团队分析Nlgn3^R451C突变导致这些核团间投射改变的内在规律，发现对丘脑、中脑和脑干中的接收神经元数目产生了特异性作用：1）Nlgn3^R451C突变极大地改变了某些核团的投射，例如对侧ZI和同侧RN和InC；2）Nlgn3^R451C突变对小脑下游对侧与同侧核团投射有不同改变，如增强了对侧ZI的投射，但几乎不影响同侧ZI；改变同侧 PF^FN的投射，但对对侧PF^FN没有影响；3）Nlgn3^R451C突变对某些核团的对侧与同侧有相同影响，如SPF^IN；4）Nlgn3^R451C突变对下游核团投射的改变与到核团的距离无相关性。

接下来，团队成员研究了Nlgn3^R451C突变对下游核团的靶神经元类型的影响，结合荧光示踪和抗体染色，发现Nlgn3^R451C突变不改变VL^IN中vGluT2⁺和GABA⁺神经元数目，而ZI^IN中glutamine⁺、parvalbulmin⁺、nNOS⁺和GABA⁺神经元数目均明显增加。

接下来，团队探究 ZIIN 和 ZIDN 神经元增多对自闭症行为的影响。首先利用化学遗传学方法，特异性地抑制ZIIN 和 ZIDN 神经元可显著恢复Nlgn3R451C突变小鼠社交趋新性；在居住入侵行为测试中，注射了CNO的突变小鼠的社交认知能力也有一定程度的恢复。进一步，使用 DIO-hM3Dq-EGFP激活野生型小鼠 ZIIN 和 ZIDN 神经元，可导致小鼠社交受损。此外，向 IN/DN 注射了AAV2/9-hSyn-oChIEF-tdTomato后，在IN/DN→ZI 环路的轴突末端同时进行了光纤刺激和微电极阵列记录。局部场电位记录表明蓝光刺激会引起 ZI 的强烈激活，与行为观察结果一致。

最后，团队探究ZI^IN和ZI^DN神经元的下游靶标，在注射跨突触示踪病毒AAV1-hSyn-Cre-EGFP的基础上，再在ZI后背侧注射非跨突触示踪病毒。结果显示ZI^IN和ZI^DN神经元投射到多个皮层和纹状体区域（尾状核、次级躯体感觉皮层和内嗅皮层）、丘脑（束旁核、丘脑后核和上丘）、中脑导水管周围灰质和脑桥网状核，其中一些核团（尾状核、内嗅皮层和中脑导水管周围灰质）已被证实与社交行为相关，提示Nlgn3^R451C突变导致的CNZI投射改变，可能是通过影响下级核团活性导致小鼠社交能力受损。

本文工作集中在两个方面：1） 追踪从小脑核到脑干、中脑和丘脑的 36 个核的 50168 个神经元投射，并创建了一个包含 50,168 个神经元的三维坐标的数据库。揭示了 Nlgn3^R451C 突变引起的小脑投射的显著差异变化。事实上，本文是首次对导致异常脑回路的疾病基因进行大规模分析。2） 首次通过控制小脑投射可以改善社交障碍，通过改变小脑核向未定带的投射可以改善自闭症小鼠社交异常，提示小脑输出失衡导致社交障碍是自闭症发病机制的重要原因。简而言之，该工作为理解小脑功能障碍导致社交互动缺陷的神经环路机制提供了重要依据。利用该方法，未来可应用于探究其他综合征和非综合征性自闭症小鼠模型中小脑-大脑连接的结构变化，对将来在小脑施加特定非侵入性刺激治疗精神疾病具有重要的临床意义。