Cell：使用Cas9记录生物事件经过的时间和时间信息

生物反应是高度动态的，尤其是在活细胞中。 因此，出乎意料的是，活细胞中这种反应的速率可能足够稳定以被用作钟表系统。 DNA是生命的遗传物质，已被提议作为记录信息的媒介。尽管DNA已被用于记录生物学信息和计算数学问题，但尚未将其用于记录时间信息。

在这里，我们发现与典型的动态生物反应相比，Cas9和gRNA产生的插入片段能够以稳定的速率发生，并且累积插入片段的频率是时间的函数。通过测量插入缺失频率，我们开发了基于CRISPR-Cas9的合成生物系统，能够以可复制的方式在培养的人类和小鼠细胞以及小鼠皮肤细胞中模拟记录和测量数小时至数周的绝对时间的方法。这些时间记录是在几种细胞类型中进行的，Cas9的启动子和递送载体不同，并且在培养的细胞和活小鼠的细胞中都进行。作为应用，我们记录了热暴露和炎症发作以来化学暴露的持续时间和经过的时间长度，因此我们的系统可以用作合成的“ DNA clock”。

为了记录经过的时间，我们利用CRISPR-Cas9系统指导插入缺失的生成，如果稳定地维持Cas9和gRNA的浓度，那么完整的靶序列频率将遵循指数衰减，可通过使用Cas9敲入细胞和U6启动子来驱动gRNA表达来达到稳定浓度。为了准确地测量各种时间段的时间，我们使用了多个目标序列。先前已经开发出高通量方法来确定数千个靶序列的插入缺失频率。为了简化该方法，我们通过使用stgRNA编码系统对其进行了修改，其中gRNA编码序列也充当目标序列。此外，为了在更长的时间内减弱stgRNA的活性以测量时间，我们在引导序列的5‘端加了65 nt的序列（包括15 nt的条形码序列和 50 nt的延伸序列）。

我们研究了目标序列的可测量时间窗口与其在系统中的半衰期之间的关系，先假设完整的目标频率将落在一个二项式分布中，后进行了300次计算仿真，发现半衰期会影响可测量的时间窗口。

既然可以通过每个目标序列来估计经过时间，那么当使用多个靶序列时，在一个时间点估计了多个时间长度（图1J）。为了准确地估计某个时间点的经过时间，我们首先滤出了目标序列，这些目标序列如上所述具有极高的（> 95％）或低的（<2％）完整目标频率。为了确定从剩余目标序列中获得每个时间点一个估计的经过时间长度的最佳方法，我们使用四分位数nps加权平均值来估计多个目标序列的经过时间。

我们首先根据完整目标频率估算重复时间，该目标频率是根据使用其他重复数据得出的半衰期得出的（保留一个重复的交叉验证），该时间估计是准确的，证实了我们经过的时间记录系统在所有副本之间都是可重现的。 

接下来，我们通过分析随机选择减少了stgRNA的数量，发现平均相对绝对误差在大约100或200个stgRNA上是可比的，此后它们随着stgRNA数量的减少而急剧波动并增加。这些数据表明，我们可以使用仅包含100或200个stgRNA的较小的文库进行相对精确的时间测量，减少目标序列和单元格数量对时间记录准确性的影响。

接下来，我们评估了在更普遍的情况下是否可以实现对经过时间的估计。使用不同的启动子和不同的细胞类型记录Cas9表达所经过的时间，代替使用克隆扩增的Cas9基因敲除细胞，Cas9表达由来自HEK293T细胞中慢病毒载体的三个不同启动子（CMV，EFS和PGK启动子）与Cas9基因敲除细胞相比，Cas9在这些慢病毒Cas9转基因细胞系中的表达将更加异质。

要成为独立的类似时钟的系统，时间记录系统不应受到外部环境的影响。为了将我们的系统暴露在不同的微环境中，我们在三维多孔聚苯乙烯支架中培养了经文库2转导的Cas9-敲入细胞，并将其移植到免疫缺陷NOG（NOD / Shi-scid / IL2Rgnull）小鼠的皮下区域。表明基于Cas9-knockin细胞的时间记录系统在在这种情况下，二维体外条件与三维体内条件之间的微环境差异几乎没有影响。我们最终测试了改变因素的组合（即不同的启动子，细胞类型和微环境）是否会影响时间记录。为了解决这个问题，我们使用了Cas9-knockin小鼠，该小鼠在Rosa26基因座中从CAG启动子表达SpCas9。将慢病毒文库2皮内注射到Cas9基因敲除小鼠的背部皮肤中，并分析了皮肤组织，该皮肤组织包含多种细胞类型，包括但不限于成纤维细胞，巨噬细胞，脂肪细胞，肥大细胞，角质形成细胞和干细胞。与上面显示的使用不同细胞类型和启动子获得的结果相似，我们观察到了经过的时间的估计长度与真实长度之间的线性相关趋势，表明即使几个因素（例如细胞类型，微环境和Cas9表达的启动子）都发生了变化，也可以估算经过的时间。

 到目前为止，还没有分子记录仪能够记录“生物事件发生时”。接下来，我们试图通过记录事件发生后经过的时间来估算事件发生的时间。我们以类似的方式将时间间隔的度量记录到活人细胞的DNA中，时间间隔从数小时到数周不等。有趣的是，我们的生物系统和辐射测年都基于指数衰减模型。

参考文献：

Jihye Park et al., Recording of elapsed time and temporal information about biological events using Cas9.Cell,Theory.Published: February 03,2021.DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.014.