Nat Commun ：哺乳动物活细胞内可编程重构RNA调控网络的人工基因线路

本研究提出一种新策略，旨在开发活细胞内高灵敏、可编程、单核苷酸分辨率的RNA感应及响应基因线路，命名为RNA-IN/RNA-OUT。该线路主要包括三个模块：上游负责内源RNA输入的RNA识别感知模块（实现RNA-IN）、下游负责内源RNA表达输出的效应模块（实现RNA-OUT），以及负责RNA信息呈递的处理模块（图1）。

图1. RNA-IN/RNA-OUT工作原理示意图（Credit: Nature Communications）

研究者首先通过“识别-激活”的策略构建了一个可编程的RNA传感器，命名为CASP传感器，发挥RNA动态信号的感知功能，构成RNA-IN模块。CASP传感器包含可编程的RNA结合蛋白（DiCas7-11）和效应蛋白（转录激活因子CI434及激活域VP64）两个部分。CASP传感器跟随crRNA引导激活蛋白酶活性，释放锚定在细胞膜的效应蛋白，达到转录调控的目的。在精密设计的基础上，为了实现对广谱RNA的灵敏感应，研究团队系统地调试与优化了CASP 传感器中的各个元件，成功检测到内源表达低至8个转录本每百万条转录本（TPM）。

除了RNA的表达异常，基因突变亦是导致癌症、血管、神经性疾病等体细胞病变的重要原因。但野生型与突变型RNA序列之间往往仅有单个核苷酸突变的微小差异，往往较难检测，也对RNA-IN模块的感应分辨率提出了更具挑战性的要求。然而，CASP传感器中，RNA感应关键元件“DiCas7-11”对单碱基突变有较高的容忍度，不足以实现单点突变的检测。研究团队系统地探索了DiCas7-11对碱基错配的容忍临界点，通过引入辅助突变位点的协同策略，在crRNA与目标RNA序列之间形成单碱基错配差，首次将原本不可检测的单点突变RNA感应由1.5倍提升至94倍。由此，成功实现单碱基突变的检测，也将RNA表达量的感应扩展至序列变化的感应，极大地丰富了RNA-IN模块的识别范围。特别地，在肿瘤关键基因KRAS、TP53、BRAF、PIK3CA、EGFR等代表性点突变的检测中，CASP感应器展示出灵敏的识别能力。

进一步地，研究团队将CASP传感器（RNA-IN）与可编程的dSpCas9-VPR内源性激活器（RNA-OUT）连接，以构成完整的RNA-IN/RNA-OUT基因线路。利用该基因线路对细胞内不同表达水平的RNA感应，及受环境因素刺激时细胞内部动态变化RNA的感应，最终实现了特定基因的转录激活。

最后，研究者在不同的细胞类型中充分展示了RNA-IN/RNA-OUT基因线路对内源性RNA的超敏感知和灵活操纵能力，包括：（1）连接持续表达的RNA以激活孕酮的内源性生物合成代谢网络；（2）动态监测细胞分化和转分化的细胞状态变化；（3）识别特征点突变的RNA选择性杀死胰腺癌和肝癌细胞。

综上所述，RNA-IN/RNA-OUT基因线路具有高灵敏、可编程、单碱基分辨率的特点；该线路在活细胞内感应RNA动态变化并直接转换为特定基因的转录调控指令，在任意的RNA之间建立强关联，有潜力重构细胞内部RNA调控网络，赋予细胞新的生物学功能。该线路在细胞与基因治疗、细胞重编程以及化合物的生物合成等领域拥有广泛的应用前景，为细胞命运的操纵提供了革新性的技术支持。