《自然·遗传学》：从息肉到肠癌，究竟发生了什么？首次从单细胞水平揭秘肠癌癌前转化特征

结直肠癌（CRC）是世界第三高发癌症。

CRC的发生发展遵循明确的规律，即由肠息肉转变为腺瘤，最后转变为腺癌。

据统计，80%的CRC带有抑癌基因APC缺失或功能丧失型突变。在肿瘤发生早期，APC突变会导致WNT通路上调以及肠上皮细胞增生。随后，其他癌症驱动基因激活（例如KRAS突变），或抑癌基因失活（例如TP53突变），会进一步促进肿瘤的恶性转化[1]。

目前，大部分CRC的研究着重于对晚期肿瘤的分析，而且分析精度局限于肿瘤整体层面，忽略了对肿瘤早期发展过程以及肿瘤微环境的关注。因此，肠上皮细胞癌变的过程，及在此过程中组织微环境中其他组分的功能，是当前CRC领域亟待解决的问题。

近日，由斯坦福大学医学院的Michael P. Snyder 和Willian J. Greenleaf领衔的研究团队，在《自然·遗传学》期刊发表了关于结直肠癌发生过程的重要研究成果[2]。

该研究团队收集了27个正常肠组织，48个肠息肉和6个CRC样本。利用这些组织，研究人员在单细胞层面建立了正常肠组织→肠息肉→CRC的转化过程中的染色质可及性和转录组图谱。

他们不仅发现肠息肉和CRC组织中都存在一群新的具有干细胞表型的上皮细胞群体，还在高级别的息肉中发现了富集的干细胞样上皮细胞，以及肿瘤微环境中的调节性Ｔ细胞（Tregs）和癌前相关成纤维细胞（preCAFs）也有所增加。

该研究第一次在单细胞层面描述了CRC癌前转化的特征，分析了造成这些特征变化的分子机制，填补了对CRC癌前转化的研究的缺失，并为癌前病变的分期和癌症风险的预测提供了详细的参考。

由于APC突变在CRC中极为普遍，而且对CRC的早期发生至关重要，因此该团队决定利用由APC胚系突变导致的家族性腺瘤性息肉病（FAP）作为研究模型。FAP患者的特征是其结肠内会形成超过100枚具有不同分期和分子层面差异的腺瘤性息肉，且这些息肉大部分会发展为CRC。

为了更全面地了解肠癌的发生发展过程，研究人员收集了健康人的结肠组织，FAP及非FAP患者的肠息肉和CRC组织。研究人员利用单细胞核转录组测序（snRNA-seq）和单细胞染色质转座酶可及性测序（scATAC-seq），来分析和比较不同阶段组织的转录组和表观遗传组的差异。

研究人员首先简单地将组织中的细胞分为上皮细胞，免疫细胞和基质细胞。在聚集分析中，来源于不同组织的免疫细胞和基质细胞均表现出明显的聚集性。而上皮细胞则呈分散式分布，形成正常组织，息肉和CRC亚群。因此，研究人员将不同组织中的免疫细胞和基质细胞分别作为整体进行分析，而将来源于不同组织的上皮细胞分别进行分析。

随后，研究人员参考已知标志基因的表达状态，对snRNA-seq数据进行注释，同时利用标志基因的染色体活跃值（在一个基因区域的染色体可及性程度）对scATAC-seq数据进行注释。

基于scATAC-seq数据，研究人员发现了一群CRC中特有的耗竭性T细胞。这群细胞的T细胞耗竭标志基因区域有高染色体活跃值，同时在耗竭性T细胞特有的DNA基序区域（例如NR4A，RUNX，CEFB，JUN，FOS和BATF）也有高染色体可及性。

另外，snRNA-seq和scATAC-seq都显示，相对于正常组织，息肉和CRC中富集调节性T细胞（Tregs），而且这些Tregs在息肉到CRC转换中持续增加，提示这些Tregs可能参与癌前转化的免疫逃逸。与这些Tregs相反，息肉和CRC中的初始B细胞，记忆型B细胞和生发中心细胞则相对正常组织有所减少。

在对基质细胞亚群的分析中，研究人员发现成纤维细胞亚群在正常组织到癌组织的转化中也有很大变化。

首先，研究人员发现了一群CRC中特有的癌相关成纤维细胞（CAFs），而且这些CAFs的染色质可及性是由转录因子RUNX1特异性调控的。

其次，通过对scATAC-seq数据的聚集分析，研究人员发现了另一群在息肉和CRC中都富集的成纤维细胞。这些细胞的染色质可及性与CAFs有部分相似（例如WNT2基因区域），因此研究人员将这群成纤维细胞定义为癌前相关成纤维细胞（preCAFs）。研究人员推断这些preCAFs可能与CAFs有相似的功能，并可能促进癌前病变的恶性转化。

研究人员还在息肉和癌组织中观察到很多具有干细胞特性的上皮细胞，而且这些干细胞样细胞的丰度随着恶性转化而上升。

基于snRNA-seq和scATAC-seq建立的细胞状态转换轨迹，研究人员发现在正常组织→息肉→CRC的恶性转化中，干细胞样上皮细胞的基因表达和染色体可及性都呈递进式变化。与之相反，分化成熟的肠细胞在恶性转化中则减少，其中杯状细胞的减少尤为明显。

因此，研究人员推断这群具有干细胞特性的细胞可能代表了癌症干细胞，而杯状细胞的缺失或许也会促进肿瘤发生。

除此之外，研究人员通过表观遗传组学分析还发现，在正常组织→息肉→癌组织的转化中，染色体发生有序的打开和关闭，同时癌症相关基因也发生有序的上调或下调。在不同的阶段，调控元件和转录因子的活性和特异性也有所不同。

在转化早期，具有转录因子TCF和LEF结合基序的染色质区域的可及性上调，由此可以推断WNT通路也逐渐上调。与此同时，调控肠干细胞命运的主要基因ASCL2的基序结合区域的染色体可及性，在息肉和CRC中也呈现上调趋势。这与研究人员观察到的干细胞样细胞群体的扩大相符。

具有转录因子HNF4A结合基序的染色质区域的可及性则表现出更高的波动性，这一区域的活性在转化早期降低，而在恶性转化阶段升高。研究人员由此推断HNF4A在息肉和CRC中可能有不同的功能。在息肉中，HNF4A活性的降低或许使WNT通路得以被激活，而在CRC中，HNF4A可能通过驱动染色质可及性变化来调控癌症特异基因的表达。

最后，研究人员还观察到，息肉中的染色质可及性程度和CRC中的DNA甲基化程度呈高度负相关。DNA甲基化异常是导致CRC发生的一个重要因素。因此，研究人员建议，可以利用该负相关性检测癌前病变，来找出具有恶化潜质的息肉组织并进行移除，进而达到预防结直肠癌的发生的目的。

总的来说，这个研究在单细胞层面揭示了在CRC恶性转化过程中染色质可及性，基因表达，DNA甲基化以及组织中细胞组分的变化。