Sci Adv│张薇/陈佳林/姚庆强开发了一种新的生物活性纤维增强水凝胶，用于肌腱连接损伤修复

肌腱肌连接（MTJ）是位于肌肉和肌腱之间的复杂和特殊组织，负责将收缩的骨骼肌产生的力量传递通过肌腱到骨骼。作为肌肉和肌腱的连接点，MTJ在日常运动或锻炼中承受着集中的机械应力，因此，MTJ损伤很常见。据报道，28%的肌肉-肌腱-骨复合体损伤发生在MTJ处，风险排名第二，仅次于肌肉、肌腱、肌腱-骨界面损伤。

目前，MTJ损伤的临床治疗包括保守治疗，如非甾体抗炎药和物理疗法，以及使用各种缝合技术进行外科手术干预。然而，存在几个限制影响其有效性，包括以下几点：（i）瘢痕组织形成导致机械强度不足，治疗后复发率高；（ii）在MTJ损伤处或附近发生缝合穿透，经常导致MTJ重建失败；（iii）难以修复大面积MTJ缺损，特别是在肌肉和肌腱损伤后收缩的情况下。因此，目前的干预措施无法促进MTJ的结构和功能修复，迫切需要开发有前景的策略进行高质量的MTJ再生。

近几十年来，组织工程学已经成为修复和再生肌肉骨骼组织的有前景策略，其中包括细胞、支架和生物分子的整合，以创建生物替代物来恢复、替代或再生受损组织。与保守治疗和外科缝合相比，基于组织工程的再生疗法在各种肌肉骨骼组织，包括肌腱-骨连接、骨骼肌和半月板等方面表现出更为引人注目的治疗效果。然而，通过组织工程策略修复MTJ具有挑战性，因为这一特殊区域的复杂生物组成和物理化学特性，包括不同的细胞类型、细胞外基质（ECM）组成和肌肉和肌腱组织的机械强度。

迄今为止，关于MTJ组织工程的发表文献数量非常有限（来自PubMed数据库），其中一些进展已经在通过构建肌腱和肌肉的生物、结构或机械仿生支架，有或无细胞种植进行了MTJ再生方面取得。尽管先前开发的支架显示了巧妙的材料设计，但它们的评估在很大程度上局限于体外评估，如机械性能或细胞相容性，缺乏对它们在体内结构和功能再生方面的有效性的必要评估。一个迫在眉睫的需要是发展多功能工程支架，具有肌腱和肌肉再生生物活性、适当的微结构和足够的机械强度，以实现MTJ的体内结构和功能再生。

除了考虑支架的特性外，应该特别关注通过调节位点生物微环境来提高MTJ再生的关键方法。鉴于MTJ是涉及两种不同组织类型的转变性区域，来自肌腱和肌肉的细胞都存在于这个界面内。此外，免疫细胞，如巨噬细胞，在MTJ损伤后参与修复级联反应。通过组织工程策略工程化一个最佳的细胞微环境成为确保这些不同细胞群体的适当生物调节的必要手段，旨在保持它们的表型并确保它们的功能，从而促进MTJ修复过程。然而，肌腱、肌肉或MTJ损伤不可避免地伴随着炎症，伴随着免疫细胞浸润（例如巨噬细胞）和促炎细胞因子分泌增加（例如白细胞介素-1β（IL-1β））。与此同时，包括羟基自由基、超氧阴离子和过氧化氢（H2O2）在内的活性氧化物种的产生与肌肉和肌腱损伤后的炎症微环境高度相关。据报道，

过量产生的促炎细胞因子和活性氧化物质显著阻碍了肌肉和肌腱的修复过程，打断了正常的细胞周期和迁移，同时诱导了细胞死亡和表型改变。在损伤后的敌对细胞微环境破坏了MTJ组织内的驻留细胞（肌腱/肌肉驻留细胞和免疫细胞）以及移植细胞的功能，从而阻碍了MTJ的再生。间充质干细胞（MSCs）是一种多能干细胞，能够在特定诱导条件下分化为各种细胞类型，包括肌腱细胞和肌肉细胞，并已用于肌腱和肌肉再生。然而，损伤后的炎症和氧化应激特征的不良微环境导致移植MSCs的存活和活力不足。因此，通过具有免疫调节和抗氧化功能的组织工程支架对受伤组织的细胞微环境进行调控成为MTJ修复的有前景策略，但在先前的MTJ组织工程研究中明显缺失。

Klotho是一种130 kDa的类型I单通路跨膜糖蛋白，以其抗衰老特性而闻名。它以多种形式存在，包括全长跨膜变体（mKl）、可溶性变体（sKl）和通过选择性剪接生成的额外分泌变体。其中，由释放的mKI生成的sKl（以下简称为Klotho）可以作为循环激素发挥抗衰老效果，通过抑制胰岛素/胰岛素样生长因子1信号级联。几项研究揭示了Klotho对恢复肌肉和肌腱/韧带系干细胞功能以进行组织再生的强大效果。鉴于肌腱和韧带之间的组成和结构高度相似，可以合理地假设Klotho也可能在肌腱中产生类似的生物学效应。此外，一项先前的研究直接比较了Klotho和N-乙酰半胱氨酸，一种广泛认可的有效抗氧化剂的效果，并发现Klotho通过抑制氧化应激来减轻DNA损伤和细胞衰老，而与N-乙酰半胱氨酸相比，引起的细胞凋亡较少。因此，将重组Klotho作为抗氧化剂和免疫调节生物分子集成到组织工程支架中，有望改善受伤组织的细胞微环境，从而促进MTJ修复过程。

含MSCs和Klotho的PLGA增强SilMA水凝胶的制备示意图(K/M@SM-PA)（Credit: Science Advances）

在这里，作者开发了一种三维打印的纤维增强多功能水凝胶，以提供足够的机械支持并为结构和功能性MTJ再生定制适当的微环境。在这种生物活性纤维增强水凝胶系统中，具有良好排列结构的三维打印聚（乳酸-羟基乳酸）酸（PLGA）支架可以提供足够的机械强度以维持MTJ的生理功能；引入MSCs可以增强肌肉和肌腱的促再生生物活性，而载入Klotho则可以改善MTJ损伤后外源MSCs和内源MTJ驻留细胞的病理环境；此外，光交联丝素甲基丙烯酰（SilMA）水凝胶被融合到PLGA支架中，作为Klotho输送的载体，并提供三维富水微环境以维持MSC的保留和存活。

在这项研究中，作者首先评估了生物活性纤维增强水凝胶的理化性能和细胞相容性。随后，将水凝胶系统植入大鼠MTJ缺损模型中，评估其在促进MTJ结构和功能再生方面的原位有效性。进行了体内蛋白质组学分析，以揭示水凝胶系统促进MTJ再生的潜在机制。根据蛋白质组学结果，作者进行了进一步的研究，以探索通过水凝胶系统调节细胞微环境是否以及如何调节移植MSCs和驻留细胞的行为，从而增强MTJ再生。