Cell：Joachim Frank/冯相松等开发基于微流控芯片的时间分辨冷冻电镜新方法

所有生命过程都涉及细胞中分子之间的相互作用。例如，核糖体是一种由蛋白质和 RNA 组成的巨大分子机器，在将遗传信息翻译成蛋白质时与转运RNA（tRNA）和多种蛋白质因子相互作用。为了深入理解这种相互作用，我们不仅需要了解其结构，还需要了解它们的瞬时中间态复合物构象以及相应变化的动态过程。这些变化非常快，对于分子机器来说在几十到几百毫秒范围内。

哥伦比亚大学的 Joachim Frank 教授为冷冻电子显微镜（cryo-EM）的发展做出了重要贡献，并因此获得了2017年诺贝尔化学奖。当前，冷冻电子显微镜技术已成为一种高分辨重构生物分子结构的强大技术。但这种方法本身样品制备（blotting method）速度太慢，无法抓捕构象变化及其动态过程，因为它需要将含有生物分子的样本溶液移到电镜载网上，吸干多余的液体，然后将载网放入冷冻剂中——这一过程至少需要几秒钟。

而最近，Joachim Frank 团队开发了一种新型时间分辨冷冻电镜方法，解决了冷冻电镜的上述缺点。

该研究以：Time resolution in cryo-EM using a PDMS-based microfluidic chip assembly and its application to the study of HflX-mediated ribosome recycling 为题，于2024年1月19日在 Cell 期刊发表，该研究开发了基于微流控芯片的时间分辨冷冻电镜方法，并揭示了HflX介导的核糖体回收动态路径。冯相松博士为共同第一作者兼共同通讯作者。

在这项最新研究中，通过这种时间分辨冷冻电镜方法，含有生物分子的两个样品通过微混合器快速混合，然后在微反应器中精确控制反应时间，该时间段在数十到数百毫秒的时间范围内。然后所得反应产物经由微喷雾器雾化以微液滴的形式喷射到载网网格上并快速冷冻（下图）。论文中的最新微流体芯片装置由冯相松博士设计，其中涉及主要材料由微纳流控领域常用PDMS制成。这种模块化微流控装芯片配体中微混合器和微喷雾器两个模块是通过微/纳米加工高精度成型，另一模块微毛细管作为微反应器连接微混合器和微喷雾器，用于控制反应时间。通过控制微反应器的体积，反应时间可以达到10毫秒的分辨率。

值得一提的是，该方法采用了等离子体增强化学气相沉积技术（Plasma-Enhanced Chemical Vapor Deposition，简称PECVD）对微混合器微通道内壁涂布SiO2涂层，从而整个微流控芯片内部表面呈现亲水行，因此可以有效降低生物分子的非特异性表面吸附（unspecific surface adsorption），进而保持反应的化学计量数并保证其可重复性。

为探究这一方法可否用于研究生物分子的中间态构象和动态过程，研究团队使用了大肠杆菌E.coli HflX-70S反应系统，其中HflX是一种保守的GTP酶，在应激条件下它可与核糖体复合物70S结合，并将70S拆分成大小亚基，进而回收核糖体。研究团队在一个样品入口通道内泵入HflX和GTP，另一个通道内泵入核糖体70S进行如上所述微混合-微反应-微喷雾（micromixing-microreacting-microspraying）和快速冷冻（fast vitrification）的样品制备程序。为了捕获反应过程中的中间态构象，反应时间分别控制为10、25、140、900毫秒。所制备的样品用于单颗粒冷冻电镜数据收集和数据处理。

通过应用这一时间分辨冷冻电镜技术，该研究追踪到了HflX 拆分核糖体的构象动态过程。结果表明了该过程的三个中间态构象（i70SHflX-I，i70SHflX-II和i70SHflX-III）以及各构象的颗粒数量（population），从而展示出一个令人惊讶的有序过程：当HflX结合到70S复合物后，大小亚基50S和30S之间的 12 个连接桥被一个接一个地拆开时，核糖体像蛤壳一样逐渐打开，直到30S从50S分离脱落（下图）。

研究团队认为许多其他动态生物过程可以采用同样的方法进行抓取，并且这一方法的开发对广泛的生物分子系统的分子动力学研究将产生重要影响，也会带来相关药物设计的进步。

哥伦比亚大学医学院生物化学和分子生物物理学系Sayan Bhattacharjee和冯相松博士为论文的共同第一作者，Joachim Frank教授和冯相松博士为论文共同共同通讯作者。此外，该研究工作得到了哥伦比亚大学医学院Frank研究组其他成员Drs. Suvrajit Maji、Prikshat Dadhwal、Zhening Zhang、Zuben P. Brown的大力支持。