Nature Methods：我们看到的病理切片，竟是细胞的“断壁残垣”？一场重塑肿瘤微环境认知的3D成像革命

一张切片的“厚度”陷阱：我们习以为常的观察方式错在哪里？

为了获得清晰的图像，避免来自焦平面以外的杂散光干扰，病理学和大多数空间蛋白质组学技术都偏爱使用极薄的组织切片。这似乎是合乎逻辑的，切片越薄，视野越“干净”。然而，这个看似合理的选择，却隐藏着一个巨大的陷阱。

研究人员首先提出了一个直击灵魂的问题：一个典型的细胞有多大？以免疫细胞为例，其直径通常在10微米左右，而肿瘤细胞的尺寸更是千差万别，很多都远大于5微米。这意味着，用5微米的“刀”去切割一个10微米的“苹果”，几乎不可能得到一个完整的苹果，我们得到的，更有可能只是一个残缺的侧面。

这项研究用严谨的数据证实了这一猜想。通过对不同厚度切片的系统性分析，他们发现，在标准的5微米厚切片中，完整的细胞核占比竟然不足5%。这意味着我们所观察的，几乎是一个由被“腰斩”的细胞核和细胞质组成的破碎世界。更重要的是，组织在脱水、包埋、再到复水的过程中，其体积会发生变化。研究数据显示，一张在切片机上设定为5微米切割的石蜡切片，在经过复水处理后，其厚度会膨胀到约9微米。即便如此，这对于容纳一个完整的细胞来说，依然捉襟见肘。

这种细胞层面的不完整性会带来怎样的灾难性后果？研究人员通过一个巧妙的“虚拟切片”实验给出了答案。他们首先对一块35微米厚的肿瘤组织进行了高分辨率的3D成像，获得了该组织区域内所有细胞完整的三维“真理”数据(ground truth)。然后，他们从这个3D数据集中，用计算机模拟切割出9微米厚的“虚拟薄片”，来模仿传统2D成像的场景。

结果令人震惊。在一个由树突状细胞(Dendritic cell, D)和两个T细胞(T1, T2)组成的微小社区中，错误频频发生。在某个虚拟薄片中，T细胞T1因为在Z轴方向上与树突状细胞D发生了重叠，而被错误地标记为PD1阳性。而在另一个虚拟薄片中，树突状细胞D的细胞核大部分位于切片之外，导致其细胞质中真实的CD11c和MX1蛋白信号，因为缺乏细胞核作为定位和分割的依据，而被当作无意义的背景噪声忽略。

从整个组织的尺度来看，这种错误是普遍存在的。数据显示，在9微米的虚拟薄片中，高达12%的真实细胞质信号因为其对应的细胞核不在切片内而无法被正确识别。对于那些在细胞内呈极化分布的蛋白（即不均匀分布，集中在细胞的某一侧），情况则更为糟糕。例如，对于LAG3和MX1这两种重要的免疫蛋白，其假阴性（即错误地判断为不存在）的比例高达30-40%。这意味着，仅仅因为切片太薄，我们就有可能漏掉近一半的关键生物学信息，从而做出完全错误的细胞功能状态判断，并严重低估细胞间相互作用的数量。

从“平面图”到“全景沙盘”：3D CyCIF技术如何重建细胞社区

既然薄切片存在如此严重的缺陷，解决方案自然是增加厚度。研究团队将循环免疫荧光技术(Cyclic Immunofluorescence, CyCIF)进行了巧妙的拓展，开发出一种适用于厚切片（30-50微米）的3D CyCIF方法。这项技术的核心思想依然是“染色-成像-漂白-再染色”的循环，但通过结合共聚焦显微镜的光学切片能力，实现了对厚组织样本的逐层扫描，最终重建出高清的3D图像。

这次，研究人员将成像的“像素”升级为了“体素”(voxel)，其空间分辨率达到了惊人的140纳米 x 140纳米 x 280纳米。这意味着什么？这意味着他们不仅能看到完整的细胞，还能清晰地洞察细胞内部的亚细胞结构。

过去，要在组织原位环境中观察细胞器，如线粒体(Mitochondria)、过氧化物酶体(Peroxisomes)或分泌颗粒(Secretory granules)，几乎是天方夜谭，这类精细的观察通常局限于体外培养的细胞。然而，借助3D CyCIF，这一切都成为了现实。研究人员在经过福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的人类肿瘤样本中，清晰地解析了这些细胞器的形态与分布。

其中最有意思的成果之一，是对组织微架构的完整重建。例如，他们成功地对一段长达100微米的皮肤真皮内毛细血管进行了完整的3D建模。在这个立体的血管管道中，大约10个内皮细胞(Endothelial cells)构成了血管壁，管道内则包裹着红细胞(erythrocytes)、中性粒细胞(neutrophil)，甚至还有一个B细胞正在上演“胜利大逃亡”——它的一部分身体已经挤出血管壁，呈现出经典的跨内皮细胞迁移(transendothelial migration)的姿态。在传统的2D薄切片中，我们最多只能看到这个复杂动态过程的一个毫无意义的横截面，而3D成像则让我们仿佛身临其境，目睹了整个事件的“犯罪现场”。

这项技术不仅让我们“看得到”，更让我们“看得清”。通过对黑色素瘤原位癌(melanoma in situ, MIS)区域的成像，研究人员发现，除了血管和细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)填充的空隙，大部分区域的细胞都处于一种高度致密的“摩肩接踵”的状态。细胞核的平均直径约为5.0微米，而整个细胞的平均长轴和短轴分别为13微米和6.1微米。这意味着相邻细胞的细胞膜间距通常只有约1微米。这种对细胞尺寸和空间排布的精确测量，为理解组织物理特性、细胞迁移和信号传导提供了至关重要的数据。

细胞社交的“窃听风云”：高分辨率3D成像揭示免疫微环境的复杂博弈

当观察的尺度从“破碎”进入“完整”，从“平面”跨越到“立体”，我们对细胞间相互作用的理解也随之发生了质的飞跃。高分辨率的3D成像，让我们得以“窃听”细胞间的悄悄话，揭示肿瘤免疫微环境中复杂而动态的博弈。

一个经典的例子是免疫检查点蛋白PD1及其配体PDL1的相互作用。在3D图像中，研究人员观察到，当一个表达PD1的T细胞与一个表达PDL1的肿瘤细胞或树突状细胞接触时，这些蛋白分子并非均匀地分布在细胞膜上，而是会聚集形成离散的“斑点”(puncta)。在一个T细胞与另一个细胞长达40平方微米的接触面上，可以同时存在多达13个这样的信号复合物“热点”，这有力地证明了细胞间正在发生活跃的、形成稳定信号平台的 juxtacrine（旁分泌）信号传导。

更令人着迷的是，3D成像揭示了一个细胞可以同时参与多场不同的“对话”。研究人员捕捉到了这样一个复杂的场景：一个PD1阳性的CD8+ T细胞，它的一侧通过纤细的伪足(filopodia)与一个肿瘤细胞紧密接触，似乎在进行“杀伤”前的准备；而它的另一侧，则与一个表达PDL1的树突状细胞结合，接收着免疫抑制信号。这还不是全部，这个T细胞还同时与一个CD4+辅助T细胞发生互动。在这个小小的空间里，一个T细胞同时接收着来自不同细胞的、功能可能完全相反（激活与抑制）的多种信号。这种“一心多用”的复杂调控网络，在2D切片中是难以想象的，我们很可能会错误地认为这只是几个细胞的随机并置。

基于对细胞膜间距和接触面积的精确测量，研究人员进一步将细胞间的相互作用分为了三种类型：

I型互作（直接结合）：细胞膜间距在70纳米左右，这与电镜下观察到的约30纳米的免疫突触(immunological synapse)结构非常接近，代表了最紧密的物理连接和信号传递。

II型互作（膜并置）：细胞膜间距在300-600纳米之间，虽然没有直接的物理连接，但广泛的膜-膜相对，为细胞因子(cytokine)等可溶性分子的 paracrine（旁分泌）信号传递创造了理想的“微环境”。

III型互作（邻里聚集）：细胞膜间距大于500纳米，但在一个局部区域内形成高密度的细胞聚集，构成了被称为“淋巴网”(lymphonets)的结构，这可能是更宏观的组织功能单元的雏形。

在一个由1个黑色素瘤细胞和10个免疫细胞组成的复杂社区中，这三种互作类型同时存在，交织成一幅令人目不暇接的细胞社交网络图谱。一个CD4+ T细胞可以与一个CD8+ T细胞形成I型直接接触，同时又与另一个CD4+ T细胞形成II型并置接触。这种多价、多模式的互动，是肿瘤微环境功能复杂性的根本来源，而3D高分辨率成像，正是破译这本“天书”的“罗塞塔石碑”。

一个肿瘤的“前世今生”：追踪黑色素瘤细胞的“变身”之路

除了揭示细胞间的动态博弈，3D成像技术也为我们探究肿瘤发生的早期事件提供了前所未有的视角。研究团队将目光投向了黑色素瘤的原位癌(MIS)阶段，这是一个恶性转化的“黎明时分”。

在3D世界中，黑色素瘤细胞的形态展现出惊人的异质性。在真皮-表皮交界处(dermal-epidermal junction, DEJ)，许多黑色素细胞仍保持着正常的树枝状形态，其功能是向周围的角质形成细胞(keratinocytes)传递保护性的黑色素。然而，一旦它们开始向上层表皮进行“pagetoid spread”(派杰样浸润)，其形态就发生了戏剧性的变化：它们失去了树枝状的突起，变得更圆、更像阿米巴原虫，呈现出一种更具运动和侵袭潜能的形态。

更有趣的是，这种形态上的转变与细胞内在状态的改变紧密相连。研究人员利用3D CyCIF技术，同时检测了包括5hmC（一种与基因表达调控相关的表观遗传修饰）、PRAME、MART1（黑色素细胞分化标志物）以及SOX9、SOX10、MITF（调控黑色素细胞命运的关键转录因子）在内的六个关键蛋白。

分析结果挑战了传统的肿瘤线性演化模型。研究并未发现一个由单一“干细胞”样祖细胞逐步演化而来的清晰路径，反而在这些早期的癌变细胞中，观察到了这六个标志物的多种多样的、看似随机的组合。这意味着，在黑色素瘤的早期阶段，细胞并非沿着一条固定的轨迹进行恶性演化，而是在经历着频繁的状态转换，表现出高度的“表型可塑性”(phenotypic plasticity)。一个细胞可以在不同的状态间“摇摆”，这或许是它们适应复杂微环境、最终获得侵袭能力的关键策略。

此外，3D成像还揭示了早期肿瘤微环境的一个重要特征：增殖活性非常低。在整个MIS区域，Ki67（一个经典的细胞增殖标志物）阳性的细胞仅占1%，而在与之相邻的、更具侵袭性的垂直生长期(vertical growth phase, VGP)区域，这个比例跃升至11%。这表明，在肿瘤的“婴儿期”，关键事件或许不是疯狂的增殖分裂，而是细胞状态的改变、迁移能力的获得以及与免疫系统的初步“试探”。

超越细胞的“社区生态学”：在空间中解读免疫信号的涟漪

最后，这项研究将我们的视野从单个细胞和小型社区，提升到了整个组织的“社区生态学”层面。通过对更大范围的组织进行3D成像，研究人员发现了一些在空间上高度组织化的功能区域，他们称之为“炎症邻里”(inflammatory neighborhoods)。

在MIS区域中，存在着一些直径约为50-100微米的“热点”区域，这些区域表现出强烈的I型干扰素(IFN)信号响应。其特征是：转录因子IRF1从细胞质易位进入细胞核，下游的效应蛋白MX1在细胞质中形成独特的生物分子凝聚体(biomolecular condensates)，同时细胞表面的MHC-I分子表达显著上调。

这些“IFN富集区域”并非随机分布，它们与关键的生物学事件高度相关。正是在这些区域，研究人员观察到大量的免疫细胞与黑色素细胞发生接触，并且，也正是在这里，黑色素细胞开始穿越真皮-表皮交界处的基底膜，迈出侵袭的第一步。这为我们描绘了一幅清晰的因果链条：局部的IFN信号激活 → 免疫细胞募集与相互作用 → 诱导肿瘤细胞状态改变 → 最终导致肿瘤侵袭。空间信息，让原本看似孤立的事件，串联成了有逻辑的故事。

同时，3D成像带来的精准细胞表型鉴定能力，也让研究人员能够更深入地剖析T细胞的谱系与状态。他们发现，在肿瘤微环境中，祖细胞样耗竭T细胞(progenitor exhausted T cells, TPEX)、记忆T细胞(memory T cells, TMEM)和效应T细胞(effector T cells, TEFF)之间，存在着广泛的表型重叠和过渡状态。空间位置分析进一步显示，TPEX细胞在物理上更接近于TMEM和TEFF细胞，这为T细胞在肿瘤内的分化与演化路径提供了直接的空间证据。

推倒高墙，看见全貌：3D空间病理学开启的新视界

这项发表于《自然·方法》的研究，如同一块投入平静湖面的巨石，激起了我们对传统组织病理学认知的巨大涟漪。过去我们所依赖的2D薄切片，在很大程度上是一个充满误导的、由细胞碎片构成的世界。这个“二维”的视角，不仅让我们丢失了细胞的完整形态，更掩盖了它们之间丰富、多维、且充满动态的相互作用。

通过将切片厚度增加数倍，并结合高分辨率的3D成像技术，研究人员为我们推倒了这堵限制视野的“高墙”，让我们得以第一次在一个接近真实(in situ)的组织环境中，以单细胞乃至亚细胞器的分辨率，去观察一个完整的、由成千上万细胞构成的“全景沙盘”。

这无疑是一个里程碑式的工作。当然，3D成像技术由于其复杂性和产生的数据量巨大，短期内可能难以完全取代传统的2D病理学诊断流程。但它的价值并非在于“取代”，而在于“校准”和“启发”。就像在地图测绘中，我们需要精确的卫星3D数据来校准和解释2D的平面地图一样，这项工作产生的“金标准”3D数据集，将成为我们理解和纠正2D空间组学数据偏差的宝贵资源。

更重要的是，它开启了一个全新的视界。在这个视界里，我们可以追踪肿瘤的起源，可以窃听细胞的对话，可以描绘免疫信号的传播，可以真正地在空间中理解健康与疾病。从“断壁残垣”到“完整社区”，这不仅仅是增加了一个维度，而是对生命复杂性的一次全新的、更为深刻的致敬。