Cell Death and Disease：类器官模型揭示 ULBP2 CAR-T 细胞对胃癌的杀伤作用
来源：肠道类器官 2025-08-12 16:30
该研究明确 UL16 结合蛋白 2（ULBP2）为胃癌潜在治疗靶点，揭示其通过激活转化生长因子 -β（TGF-β）信号通路促进癌相关成纤维细胞（CAFs）活化及肿瘤进展的机制。
该研究聚焦胃癌治疗难题，针对其致密基质微环境导致的治疗 resistance 问题，发现 ULBP2 通过激活 TGF-β 信号通路促进癌相关成纤维细胞活化，加剧肿瘤进展。研究者开发的 ULBP2 CAR-T 细胞，在体外可有效清除胃癌细胞系及患者来源类器官，体内在细胞系衍生异种移植和患者来源异种移植模型中，单独或联合抗 PD-1 抗体均显著抑制肿瘤生长、延长生存期，还能减少基质沉积、促进 T 细胞浸润。这项工作为胃癌免疫治疗提供了新靶点与联合策略，对实体瘤 CAR-T 疗法发展具有重要参考价值。
技术路线图
科学背景与研究现状
胃癌（Gastric Cancer, GC）作为全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病，在肿瘤领域占据着极为重要的地位。从全球疾病负担角度来看，其发病率位居所有恶性肿瘤的第五位 ，每年新增病例超百万；而死亡率更是高居第三位，成为导致癌症相关死亡的主要原因之一 。在地域分布上，胃癌呈现出显著的不均衡性，东亚地区堪称胃癌的高发地带，以中国为例，全球近 44% 的胃癌新发病例集中于此 。如此高的发病率与死亡率，使得胃癌的防治成为医学领域亟待攻克的难题。
深入剖析胃癌的发病机制，是探寻有效防治策略的关键所在。已知幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）慢性感染是引发胃癌的主要危险因素，尤其是对于非贲门部胃癌，约 90% 的患者幽门螺杆菌血清学检测呈阳性 。此外，不良的生活习惯，诸如过度饮酒、吸烟，以及长期摄入高盐、含大量防腐剂的食物等，均在胃癌的发生发展进程中扮演着推波助澜的角色 。在分子机制层面，肿瘤的形成与演进涉及多个复杂环节，其中肿瘤突变负荷增加、免疫逃逸现象以及表观遗传修饰改变等，都与胃癌的发生发展密切相关 。比如，DNA、RNA 以及蛋白质层面的甲基化修饰，作为常见的表观遗传修饰方式，在胃癌的发生发展中发挥着重要作用 。然而，尽管目前对胃癌发病机制有了一定程度的认识，但距离全面清晰地阐明仍有很长的路要走，诸多细节与潜在机制仍有待深入挖掘。
胃癌的临床诊疗现状同样面临着诸多严峻挑战。由于胃癌早期症状隐匿，缺乏特异性表现，多数患者确诊时病情已进展至中晚期。以我国为例，高达 70% 的患者在确诊时已处于进展期 。这一现状极大地限制了治疗手段的选择与疗效。在传统治疗方案方面，以铂类药物为代表的一线治疗方案，对于晚期胃癌的疗效极为有限，且往往伴随着显著的副作用，极大地降低了患者的生活质量 。即便近年来免疫治疗如程序性死亡受体 1（Programmed Death Receptor 1, PD-1）抑制剂联合化疗等方案的出现，在一定程度上改善了部分患者的预后，但整体效果仍不尽人意。例如，PD-1 抑制剂联合化疗的方案，患者的总生存期（Overall Survival, OS）仅为 12.9 个月 ，且免疫治疗的响应率有限，并非所有患者都能从中获益 。在围手术期治疗领域，虽然新辅助化疗联合免疫治疗在部分 Ⅱ 期研究中展现出一定的缩瘤降期效果，但在 Ⅲ 期临床研究中，如 KEYNOTE-585 研究，未能在全人群中将围手术期病理缓解转化为长期生存获益 。这一系列问题充分表明，当前胃癌的治疗手段远未达到理想状态，亟待创新治疗靶点与策略的出现。
在这样的背景下，针对胃癌的深入研究显得尤为必要且意义重大。一方面，深入探究胃癌发生发展的分子机制，有望挖掘出全新的治疗靶点，为开发更具针对性、更有效的治疗手段奠定基础 。另一方面，优化现有治疗方案，精准筛选出能够从不同治疗手段中获益的人群，提高治疗的有效性与安全性，也是当务之急 。此外，开发新的诊断技术，实现胃癌的早期精准诊断，对于改善患者预后、降低死亡率具有不可估量的价值 。本研究聚焦于胃癌治疗难题，围绕致密基质微环境导致的治疗抵抗问题展开，致力于发现新的治疗靶点，开发创新治疗策略，以期为胃癌的临床治疗带来新的曙光，这对于填补当前胃癌研究空白、突破治疗瓶颈、提升患者生存质量与延长生存期，无疑具有深远的科学意义与临床应用价值。
实验技术方法
1. 胃癌类器官（Gastric Cancer Organoids）的分离与培养
样本来源
关键试剂
详细步骤
肿瘤组织用含 2 mM 谷氨酰胺和 10% FBS 的 DMEM/F12 洗涤后，用剪刀剪碎为小块；
加入 0.1 mg/mL 胶原酶 IV，37°C 恒温消化 30 分钟，期间轻柔震荡；
加入等量洗涤培养基终止消化，通过 100 μm 细胞筛过滤，收集筛上的细胞团；
300 g 离心 5 分钟，弃上清，细胞团重悬于 50% Matrigel 与 50% 类器官培养基的混合液中；
以 50 μL 液滴形式接种到预热的 24 孔板中央，37°C、5% CO₂培养箱中静置 30 分钟使 Matrigel 固化；
每孔加入 0.5 mL 类器官培养基，每 3-4 天更换一次培养基，观察类器官生长状态。
2. 类器官与癌相关成纤维细胞（CAFs）的共培养
目的
模拟肿瘤微环境中类器官与 CAFs 的相互作用，研究 ULBP2 对 CAF 活化的影响。
关键试剂
预冷磷酸盐缓冲液（PBS）、胰酶、共培养培养基、Matrigel。
详细步骤
类器官从 Matrigel 中解离，用预冷 PBS 反复洗涤以去除残留基质，计数后重悬于共培养培养基；
贴壁培养的 CAFs 用胰酶消化，离心后重悬于共培养培养基并计数；
按比例混合类器官与 CAFs，加入 Matrigel 和共培养培养基，制成 50 μL 液滴接种到 24 孔板；
37°C、5% CO₂下固化 30 分钟，加入 0.5 mL 共培养培养基，每 2-3 天换液；
共培养 6 天后，收集培养基、类器官及 CAFs，用于后续检测（如 α-SMA 免疫荧光染色、细胞因子检测等）。
3. 类器官的检测方法
形态学观察
通过倒置显微镜观察类器官的大小、形态及增殖状态，记录生长动力学。
免疫荧光染色
固定类器官后，用抗 Ki-67（增殖标志物）、抗 ULBP2 抗体孵育，荧光二抗显色，DAPI 染核，通过共聚焦显微镜观察蛋白表达与定位。
细胞毒性实验
将 ULBP2 CAR-T 细胞与类器官按不同效靶比（E:T）共培养，通过 LDH 释放法检测类器官杀伤率，计算 CAR-T 细胞的特异性杀伤能力。
二、CAR-T 细胞制备与功能检测技术
1. 抗 ULBP2 单克隆抗体（mAb）的制备
免疫方案
6 周龄 C57BL/6 小鼠经皮下多点注射 1×10⁶稳定表达 ULBP2 的 HEK-293T 细胞，共免疫 3 次；末次免疫后 5 天，用 2×10⁶相同细胞加强免疫。
抗体生产
采用 Microfluid-based Antibody Tech（MBAT）技术，通过脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤，筛选特异性识别 ULBP2 的单克隆抗体。
2. ULBP2 CAR 的构建与慢病毒生产
CAR 结构
第二代 CAR，包含抗 ULBP2 单链可变片段（scFv）、人 CD8 铰链区和跨膜区、4-1BB 共刺激域、CD3ζ 信号域（图 5A）。
慢病毒生产
关键试剂：HEK-293T 细胞、Lenti-CAR 质粒、psPAX2（包装质粒）、pMD2G（包膜质粒）、Lipofectamine 2000、0.45 μm 滤膜。
步骤：HEK-293T 细胞接种于 10 cm 培养皿，18 小时后按比例共转染 CAR 质粒、psPAX2 和 pMD2G；6 小时后换液，60 小时后收集上清，1000×g 离心 10 分钟去除细胞碎片，0.45 μm 滤膜过滤，浓缩病毒液备用。
3. ULBP2 CAR-T 细胞的制备与功能验证
T 细胞分离
从人外周血单个核细胞（PBMCs）中用 EasySep Human T Cell Isolation Kit（STEMCELL, 17951）富集 CD3⁺ T 细胞。
活化与转导
T 细胞用 CD3/CD28 磁珠（Gibco, 11131D）以 1:2 比例活化，加入 10 ng/mL IL-2；24 小时后加入慢病毒液，32°C、1000×g 离心 90 分钟转导，10 小时后换液。
功能检测
杀伤实验：LDH 法检测 CAR-T 细胞对 ULBP2⁺胃癌细胞系（如 MKN-45）及类器官的杀伤效率（图 5D、G）。
细胞因子检测：ELISA 法检测共培养上清中 IFN-γ 和颗粒酶 B 的浓度，评估 CAR-T 细胞的活化程度（图 5E）。
三、动物模型构建技术
1. 细胞系衍生异种移植（CDX）模型
细胞准备
MKN-45 细胞稳定表达 ULBP2 和萤火虫荧光素酶（MKN-45-ULBP2-T2A-Luc），调整浓度为 3×10⁶ cells/100 μL。
接种与处理
6 周龄 NSG 小鼠右侧皮下注射 100 μL 细胞悬液（含 50% Matrigel）；待肿瘤体积达 90 mm³ 时，尾静脉注射 6×10⁶ ULBP2 CAR-T 细胞，联合组每 5 天腹腔注射 10 mg/kg 抗 PD-1 抗体。
监测
通过生物发光成像监测肿瘤生长，定期测量肿瘤体积和小鼠体重，记录生存期（图 6B-D）。
2. 患者来源异种移植（PDX）模型
组织接种
新鲜胃癌组织切成 10 mm³ 小块，皮下接种到 6 周龄 NSG 小鼠，进行 serial transplantation 至第三代（P3）。
治疗与检测
P3 代小鼠肿瘤达 90 mm³ 时，按 CDX 模型方案处理；终点时收集肿瘤组织，进行 HE 染色、Ki-67 免疫组化及 CD8⁺ T 细胞浸润检测（图 7E-G）。
四、分子与细胞生物学检测技术
1. 基因编辑技术（CRISPR/Cas9）
目的
敲除胃癌细胞系（如 SNU-216、MKN-45）中的 ULBP2 基因，研究其功能。
步骤
设计 ULBP2 特异性 gRNA（序列见表 S2），构建 pLentiCRISPR-V2 载体；转染胃癌细胞，嘌呤霉素筛选稳定敲除细胞系，通过流式细胞术和 Western blot 验证敲除效率（图 2A）。
2. 转录组与通路分析
RNA 测序
提取 ULBP2 敲除与野生型 MKN-45 细胞的总 RNA，进行转录组测序，筛选差异表达基因（DEGs）。
通路富集
利用 GO 和 KEGG 数据库对 DEGs 进行富集分析，发现 TGF-β 信号通路和 ECM - 受体相互作用是主要受影响的通路（图 3B、C）。
3. 免疫组织化学（IHC）与组织染色
IHC 检测
肿瘤组织石蜡切片脱蜡后，用抗 ULBP2、Ki-67、CD8 抗体孵育，DAB 显色，苏木素复染；通过 H-score（染色强度 × 阳性细胞比例）定量蛋白表达（图 1G、7F）。
基质染色
Masson 三色染色和 Sirius 红染色检测肿瘤组织中胶原的沉积量，评估基质致密程度（图 1I、7H）。
科普说明
类器官
一种在体外由干细胞或肿瘤细胞培养形成的 3D 结构，具有与来源器官相似的组织学特征和功能，能更好地模拟体内微环境，是研究肿瘤生物学和药物筛选的理想模型。
CAR-T 细胞
通过基因工程改造的 T 细胞，表达能特异性识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR），可精准杀伤肿瘤细胞，目前在血液肿瘤中疗效显著，本研究探索其在实体瘤（胃癌）中的应用。
PDX 模型
将患者肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内，保留了原肿瘤的异质性和微环境特征，是评估新疗法临床转化潜力的 “金标准” 模型。
关键结果图表
该研究针对胃癌（GC）治疗中存在的致密基质微环境、缺乏有效治疗靶点及 CAR-T 细胞疗法在实体瘤中疗效有限等问题展开，提出猜想：ULBP2 可能通过激活 TGF-β 信号通路促进癌相关成纤维细胞（CAFs）活化，参与胃癌进展，而靶向 ULBP2 的 CAR-T 细胞或许能有效抑制胃癌，联合抗 PD-1 抗体可增强疗效。
为验证上述猜想，研究者首先通过 mRNA 芯片和单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析，对比 16 例胃癌患者肿瘤与邻近正常组织的差异表达基因，结合 ECM 相关基因和免疫相关基因筛选，发现 ULBP2 在胃癌中高表达且与 ECM 通路相关（图 1A、B）。随后，通过 Western blot、免疫组织化学（IHC）等实验，证实 ULBP2 在胃癌组织中 mRNA 和蛋白水平均显著升高，且高表达与更差的总生存期（OS）及胶原沉积正相关（图 1E-J）。为探究 ULBP2 的功能，研究者利用 CRISPR/Cas9 技术在 SNU-216 和 MKN-45 细胞中敲除 ULBP2，发现其显著降低细胞增殖、侵袭和迁移能力，诱导凋亡；而过表达 ULBP2 则促进 AGS 和 HGC-27 细胞的恶性表型，在类器官模型中也观察到类似结果（图 2B-E），动物实验中 ULBP2 敲除的 MKN-45 细胞在细胞系衍生异种移植（CDX）模型中生长更慢（图 2F-G）。
进一步探究机制时，转录组分析显示 ULBP2 敲除显著影响 TGF-β 信号通路和 ECM - 受体相互作用（图 3B、C），qRT-PCR 和 Western blot 证实 ULBP2 敲除降低 TGF-β1 mRNA 及蛋白水平，减少 SMAD2 磷酸化（图 3G-H），且影响上皮间质转化（EMT）相关分子表达。通过条件培养基和 Transwell 共培养实验，发现 ULBP2 敲除的胃癌细胞上清液显著抑制 CAF 增殖，减少 TGF-β 和胶原水平（图 4B-G），类器官与 CAF 共培养显示 ULBP2 敲除抑制 α-SMA 活化（图 4H-I），表明 ULBP2 通过 TGF-β 通路促进 CAF 活化和基质沉积。
在治疗策略方面，研究者构建了第二代 ULBP2 CAR-T 细胞（含抗 ULBP2 scFv、CD8 铰链、4-1BB 共刺激域和 CD3ζ 信号域），转导效率达 90.7%（图 5B），其能特异性识别并杀伤 ULBP2⁺胃癌细胞（MKN-45、SNU-216）及患者来源类器官，释放 IFN-γ 和颗粒酶 B（图 5D-G），且在类器官与 CAF 共培养中抑制 CAF 活化（图 5H）。动物实验中，ULBP2 CAR-T 细胞在 CDX 模型中单独或联合抗 PD-1 均显著抑制肿瘤生长，延长生存期，增加血清中 IFN-γ 和颗粒酶 B 水平，减少 T 细胞耗竭标志物（PD-1、LAG-3、TIM-3）表达（图 6B-F）；在患者来源异种移植（PDX）模型中，联合治疗显著延长生存期，增加 CD8⁺T 细胞浸润，减少基质沉积和 CAF 活化（图 7B-I），且无严重细胞因子释放综合征（CRS）。
总结与结论：该研究证实 ULBP2 在胃癌中高表达，通过激活 TGF-β 信号通路促进 CAF 活化和胶原沉积，形成致密基质微环境，促进肿瘤进展；开发的 ULBP2 CAR-T 细胞能特异性杀伤胃癌细胞和类器官，单独或联合抗 PD-1 在 CDX 和 PDX 模型中显著抑制肿瘤生长，延长生存期，为胃癌治疗提供了新靶点和联合策略。未来可进一步探索 ULBP2 CAR-T 在临床中的剂量优化、与其他疗法的联合效果，以及 ULBP2 调控 TGF-β 通路的更精细机制等问题。
特色与创新之处
该研究在胃癌免疫治疗领域展现出多方面特色与创新，具体如下：
其一，识别 ULBP2 作为胃癌新的特异性治疗靶点。研究通过 mRNA 芯片、单细胞 RNA 测序及临床样本验证，发现 ULBP2 在胃癌组织中显著高表达，而在正常组织中几乎不表达，且其高表达与患者不良预后及胶原沉积密切相关。这一发现突破了现有胃癌治疗靶点（如 CLDN18.2）的局限，为胃癌的精准靶向治疗提供了新的特异性分子，其组织表达的特异性也降低了治疗相关毒副作用的潜在风险。
其二，揭示 ULBP2 调控胃癌致密基质微环境的全新机制。研究首次证实，ULBP2 通过激活 TGF-β 信号通路，促进癌相关成纤维细胞（CAFs）活化及胶原沉积，进而形成不利于免疫细胞浸润的致密基质微环境。这一机制将 ULBP2 的 oncogenic 作用与肿瘤微环境重塑关联，深化了对胃癌进展中 “肿瘤细胞 - 基质细胞” 相互作用的理解，为通过靶向分子打破基质屏障、改善免疫治疗响应提供了理论依据。
其三，开发 ULBP2 CAR-T 细胞疗法并验证其协同抗 PD-1 的增效价值。研究构建了基于抗 ULBP2 单克隆抗体的第二代 CAR-T 细胞，该细胞能特异性识别并杀伤 ULBP2 阳性胃癌细胞及患者来源类器官，且在细胞系衍生异种移植（CDX）和患者来源异种移植（PDX）模型中，单独或与抗 PD-1 联合使用均显著抑制肿瘤生长、延长生存期。尤为重要的是，联合治疗可减少 T 细胞耗竭标志物（PD-1、LAG-3、TIM-3）的表达，增加 CD8⁺T 细胞浸润，这为实体瘤中 CAR-T 与免疫检查点抑制剂的协同应用提供了新范式。
其四，多维度模型验证提升研究的临床转化价值。研究结合胃癌细胞系、患者来源类器官、CDX 模型及 PDX 模型，从体外到体内、从标准化模型到临床相关性更高的个体化模型，系统验证了 ULBP2 的作用及 ULBP2 CAR-T 的疗效。特别是患者来源类器官和 PDX 模型的应用，最大限度保留了肿瘤的异质性和微环境特征，使研究结果更贴近临床实际，为后续临床转化奠定了坚实基础。
其五，证实 ULBP2 CAR-T 对肿瘤微环境的调节作用。不同于传统 CAR-T 仅靶向杀伤肿瘤细胞的单一机制，该研究发现 ULBP2 CAR-T 细胞还能减少基质沉积、抑制 CAF 活化，改善肿瘤微环境的免疫抑制状态。这一 “双重作用”（直接杀伤肿瘤细胞 + 调节微环境）提升了 CAR-T 在实体瘤中的治疗潜力，为解决实体瘤中 CAR-T 疗效受限的难题提供了新思路。
可以改进的地方[AI基于大数据总结，仅供参考]
该研究虽在胃癌靶向治疗领域取得重要进展，但仍存在以下不足，结合研究实际可从多方面优化完善：
其一，动物模型的免疫环境模拟有限。研究采用的 NSG 小鼠（NOD-Prkdc scid / Il2rg^em1）缺乏成熟 T、B 和 NK 细胞，虽能支持异种移植，但无法完全模拟人类免疫系统的复杂性。这导致 CAR-T 细胞在体内的存活、扩增及与宿主免疫细胞的交互作用难以真实反映临床情况，例如细胞因子释放综合征（CRS）的潜在风险可能被低估 —— 研究中虽未观察到严重 CRS，但在更接近人类免疫环境的模型中可能呈现不同结果。建议后续使用人源化小鼠模型（如 NSG-SGM3，具备功能性髓系细胞和 NK 细胞），更精准评估 CAR-T 的安全性及与内源性免疫的协同效应。
其二，ULBP2 调控 TGF-β 通路的分子机制尚未完全阐明。研究证实 ULBP2 敲除可降低 TGF-β1 表达及 SMAD2 磷酸化，但未明确 ULBP2 与 TGF-β 通路的直接分子互作（如是否通过结合 TGF-β 受体或上游调控因子发挥作用）。此外，ULBP2 作为 GPI 锚定蛋白，其胞外域是否通过旁分泌或自分泌方式影响 CAF 活化，仍缺乏直接证据。建议通过免疫共沉淀、表面等离子体共振（SPR）等技术验证 ULBP2 与 TGF-β 通路关键分子的结合，结合磷酸化蛋白组学解析下游信号级联，明确其调控的具体节点。
其三，CAR-T 细胞的体内持久性与肿瘤微环境适应能力数据不足。研究提到 CAR-T 细胞在小鼠体内有扩增，但未提供长期（如超过 4 周）的存活及功能状态跟踪。实体瘤微环境中的免疫抑制因子（如 IL-10、TGF-β）可能导致 CAR-T 细胞耗竭，而研究中仅检测了治疗后 21 天的耗竭标志物（PD-1、LAG-3 等），长期持久性数据的缺失限制了对治疗效果稳定性的评估。建议延长动物实验周期，通过流式细胞术动态监测 CAR-T 细胞的比例、表型（如 CD4/CD8 比例、记忆细胞标志物）及细胞因子分泌能力，同时检测肿瘤微环境中代谢物（如腺苷、乳酸）对 CAR-T 功能的影响。
其四，患者样本的异质性覆盖不足。研究中类器官、PDX 模型主要来自少数患者（如 PDX 模型仅提及 1 例患者样本），且未按胃癌亚型（如弥漫型、肠型）或分子分型（如 EBV 阳性、微卫星不稳定型）分层分析。胃癌的高度异质性可能导致不同亚型对 ULBP2 CAR-T 的响应存在差异，而现有数据难以支撑对不同患者群体的疗效预测。建议扩大患者样本量（至少纳入 10 例以上不同亚型患者），通过单细胞测序分析不同亚型中 ULBP2 的表达模式及与疗效的关联，明确 ULBP2 CAR-T 的适用人群。
其五，联合治疗的协同机制解析不充分。研究显示 ULBP2 CAR-T 与抗 PD-1 联合可增强疗效，但未明确协同作用的核心机制：是 CAR-T 细胞减少导致免疫抑制的 CAF，间接增强抗 PD-1 的响应；还是通过上调 CD8⁺T 细胞的效应功能，或下调肿瘤细胞 PD-L1 表达？虽检测到 CD8⁺T 细胞浸润增加和耗竭标志物减少，但缺乏对免疫检查点分子（如 PD-L1、CTLA-4）表达变化及细胞因子（如 IL-2、IFN-γ）网络的系统分析。建议通过流式细胞术检测肿瘤细胞和免疫细胞表面 PD-L1 的表达，结合 RNA 测序分析联合治疗后免疫相关通路的富集情况，明确协同作用的关键分子机制。
综上，通过优化动物模型、深化分子机制、扩大样本覆盖及解析协同机制，可进一步提升研究的临床转化价值，为胃癌精准免疫治疗提供更坚实的理论和实验依据。
该研究明确 UL16 结合蛋白 2（ULBP2）为胃癌潜在治疗靶点，揭示其通过激活转化生长因子 -β（TGF-β）信号通路促进癌相关成纤维细胞（CAFs）活化及肿瘤进展的机制。开发的 ULBP2 CAR-T 细胞能有效清除胃癌细胞和类器官，单独或联合抗 PD-1 抗体在细胞系及患者来源异种移植模型中显著抑制肿瘤生长、延长生存期，减少基质沉积并促进 T 细胞浸润。为胃癌免疫治疗提供新靶点与联合策略，对实体瘤 CAR-T 疗法发展具重要参考价值。
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