Nature Biotechnology：小身材，大作为，研究人员如何“炼”出超强迷你基因编辑器NovaIscB？

海选千里：在自然宝库中寻找更好的起点

为了找到一个更好的出发点，研究人员进行了一场针对IscB直系同源蛋白（orthologs）的大规模“海选”。他们首先筛选并测试了144种IscB蛋白和6种与IscB演化关系较近的II-D型Cas9蛋白在体外的活性，并确定了它们的靶点相邻基序（TAM）偏好。在这个初步阶段，发现除了之前报道的OgeuIscB，还有TbaIscB和两种II-D型Cas9蛋白表现出体外活性。这些蛋白的一个共同特点是，它们的桥接螺旋（Bridge Helix, BH）和RuvC-II区域之间插入了REC结构域，类似于OgeuIscB中的β折叠REC连接体。

这促使其进行了第二轮更有针对性的搜索，重点寻找包含这类REC插入结构域的IscB蛋白。他们又筛选了240种IscB蛋白，并在体外和人类细胞中进行了测试。最终，共鉴定出了10种在人类细胞中表现出基因编辑潜力的IscB蛋白以及2种II-D型Cas9蛋白。

在这批“候选人”中，OrufIscB（492个氨基酸）脱颖而出。通过对20个不同靶点进行测试，OrufIscB在人类细胞中表现出最高的插入-删除（indel）效率，在14个位点检测到了indel，效率范围在0.2%到8%之间。这比之前报道的OgeuIscB系统的活性提高了5到10倍。OrufIscB主要识别NTAAA TAM，但也能识别非规范的ATAAA TAM。

研究人员进一步探究了OrufIscB的“有效引导长度”（effective guide length），也就是为了实现切割活性所需的最小引导-靶标匹配碱基数。结果显示，OrufIscB在使用14-15 nt引导RNA时效率最佳，使用短至13 nt的引导RNA也能检测到活性。相比之下，SpCas9通常需要18-20 nt的引导RNA，且在使用短于16 nt的引导RNA时几乎没有活性。IscB相对较短的有效引导长度（14-15 nt vs SpCas9 18-20 nt）可能是其特异性较低的一个原因，因为完美匹配的短引导序列在人类基因组中有更多的潜在非靶点。因此，提高IscB的有效引导长度是增强特异性的关键。

智慧嫁接：为“小身体”植入“大智慧”——引入REC结构域

基于OrufIscB，研究人员开始了蛋白质工程的征程，目标是同时提升活性和有效引导长度。其核心想法是借鉴Cas9系统通过其REC结构域与引导RNA:靶标DNA异源双链体互作的方式，在OrufIscB中插入或工程化类似REC的结构域，以增强其对延伸异源双链区域的识别和稳定性，从而增加有效引导长度并提高错配检测能力。

通过AlphaFold2对多种IscB和Cas9蛋白结构进行建模，研究人员发现Cas9的REC结构域是一个广泛的插入区域，可以与RNA:DNA异源双链体的TAM远端区域相互作用。研究人员推测，将REC结构域插入OrufIscB的合适位置，可以增加蛋白质与引导-靶标异源双链体接触的表面积，从而可能提高有效引导长度。

研究人员在OrufIscB骨架中选择了REC结构域的插入位点，并构建了14个OrufIscB-REC嵌合体。在体外DNA切割实验中，其中12个嵌合体保留了DNA切割活性。进一步在人类细胞中测试发现，来自II-D型Cas9蛋白（如Nba-1）和CzcbIscB的REC结构域嵌合体表现出显著活性。特别是包含Nba-1 REC结构域的嵌合体，称之为OrufIscB-REC，在人类细胞中的活性平均提高了高达20倍。

然而，初步的点突变测试显示，简单的点突变可能会影响蛋白与DNA的整体结合亲和力，而不能显著区分靶点和非靶点结合。需要一种更精妙的方法来提高特异性。

精雕细琢：重塑REC区域，平衡活性与特异性

为了创造一个更高特异性的NovaIscB变体，研究人员在第三步工程化中着重优化OrufIscB-REC。其策略是修改蛋白质柔性区域中的多个残基，特别是通过交换Nba-1 REC结构域中的突出环（extruding loops），希望借此引入新的上位效应（epistatic effects），使系统能够优先结合靶点DNA而非非靶点DNA。研究人员利用了自然界中REC结构域的多样性，从其他REC结构域中提取了不同的环序列进行交换。

他们构建了52个单一环交换变体，并在人类细胞中测试了它们在使用20 nt和14 nt引导RNA时的活性。发现其中一个交换变体（swap 49）在不降低活性的情况下，显著提高了使用20 nt和14 nt引导RNA时的indel活性比率，表明它可能比OrufIscB-REC更具特异性。Swap 49源自NbaCas9-2蛋白。

为了理解swap 49提高特异性的机制，研究人员解析了OrufIscB-REC-swap 49的低温电子显微镜（cryo-EM）结构，分辨率达到了2.72 Å。结构显示，插入的REC结构域向引导-靶标异源双链体的TAM远端延伸，稳定了更长的异源双链区域。特别是，结构中可以看到引导-靶标异源双链体被解析到20 bp，而之前OgeuIscB的结构只解析到14 bp。这印证了增加有效引导长度的设想。此外，结构还揭示了IscB的催化切割机制：HNH结构域通过一个三方组氨酸簇协调一个镁离子进行切割，RuvC结构域协调两个镁离子。这些结构细节为进一步工程化提供了重要线索。

研究人员将表现最佳的单一环交换变体组合起来，构建了54个双环交换组合。在人类细胞中测试这些组合发现，某些双环交换组合在保持与OrufIscB-REC相似的靶点活性的同时，显著降低了使用14 nt引导RNA时的活性，使得使用20 nt和14 nt引导RNA时的活性差异高达200倍。其中，组合12表现最佳，它包含来自NbaCas9-2 REC区域3的swap 49以及来自其他宏基因组来源的II-D型Cas9的REC区域2中的一个环。他们将组合12称之为NovaIscB。

体外实验显示，NovaIscB的有效引导长度增加到15-16 nt。在人类细胞中，NovaIscB在使用19-20 nt引导RNA时活性最佳，且相比OrufIscB-REC，它在使用短于17 nt的引导RNA时活性显著降低，进一步提高了特异性。

研究人员将NovaIscB与野生型OrufIscB和OrufIscB-REC在更多靶点上进行了比较。结果显示，NovaIscB的indel活性高达约40%，相比之前报道的OgeuIscB活性提高了约100倍。在使用20 nt引导RNA时，NovaIscB在人类细胞中表现出的脱靶切割特异性与SpCas9和AsCas12f-YHAM相当。使用tagmentation-based tag insertion site sequencing (TTISS) 方法，发现NovaIscB的脱靶TTISS读数平均为14.3%，而SpCas9为10.2%，AsCas12f为10.6%。更重要的是，NovaIscB的特异性显著高于早期工程化版本的OgeuIscB和eIscB，这两种蛋白的脱靶TTISS读数均高达77.6%。这表明NovaIscB在实现高活性的同时，成功维持了高特异性。

“隐身衣”减负：优化ωRNA，让递送更轻松

蛋白质工程之外，研究人员还对OrufIscB系统的引导RNA（ωRNA）进行了结构引导的优化。其目标是减小ωRNA的尺寸，同时可能通过提高稳定性来增加其表达水平，从而优化系统在有限载货容量（如AAV）和低表达环境下的递送效率。基于OrufIscB ωRNA的低温电镜结构，研究人员锁定了其非结构化的3'末端和5'引导适配器发夹结构进行改造。

他们逐步截短了ωRNA的3'末端，发现在体外和人类细胞中，即使截短了高达21 nt，切割活性仍能维持或略有改善。同时，从5'引导适配器发夹的顶部开始逐步截短，发现在与之前验证高活性的OrufIscB-KRK蛋白结合时，可以去除42 nt（A12-A57区域），而活性没有明显损失。

研究人员将42 nt（5'）和17 nt（3'）的截短（总共移除了59 nt）结合起来，得到了一个更短的166 nt ωRNA骨架。当与NovaIscB蛋白结合时，这个缩短的ωRNA在所有测试的靶点上都表现出强大的活性。此外，这个缩短的ωRNA在人类细胞中的表达水平比野生型ωRNA骨架提高了大约4倍。总体而言，通过移除多个次级结构，成功减小了ωRNA的尺寸，并提高了其表达水平。

一专多能：NovaIscB的基因编辑“十八般武艺”

NovaIscB的出色表现使其不仅仅局限于产生indel。研究人员进一步探索了它作为通用基因组操作工具的潜力。通过将其核酸酶活性失活（dNovaIscB，D61A/H347A双突变），并与DNA甲基转移酶（Dnmt3A-3L）和转录抑制结构域（KRAB）融合，构建了一个可编程的转录抑制系统，称之为OMEGAoff。这种融合结构（N端Dnmt3A-3L，C端KRAB）与基于Cas9的CRISPRoff系统结构类似。

在人类和鼠类细胞中测试发现，OMEGAoff能够有效抑制多种靶基因的表达，包括临床相关的Pcsk9和Ttr基因。其抑制水平与基于Cas9的CRISPRoff系统相当。通过RNA作为OMEGAoff组分的递送，研究人员也在靶向ASCL1和FABP4时实现了强力抑制，最佳抑制效果出现在ωRNA与mRNA质量比为2:1时。

更重要的是，在靶向FABP4启动子区域进行亚硫酸氢盐测序（bisulfite sequencing）发现，与非靶向ωRNA相比，靶向性ωRNA在FABP4启动子区域的CpG位点甲基化水平升高。这表明观察到的转录抑制是OMEGAoff介导的甲基化所致。通过瞬时转染实验，OMEGAoff的抑制效果可以持续长达21天，这提示改变的甲基化模式可能带来持久的抑制，即使OMEGAoff表达消失后。

除了抑制，研究人员也将失活的dNovaIscB与VP64, p65和Rta（VPR）转录激活结构域融合，构建了OMEGAon系统，用于基因上调。这个系统也能够显著提高靶基因表达，水平与基于dCas9的CRISPRon系统相似。这些结果共同表明，NovaIscB-KRK具有介导多种基因组操作模式的灵活性，并且由于其与Cas9系统在机制上的相似性，可以利用为Cas9优化的系统进行直接的构建设计。

深入体内：AAV递送OMEGAoff，实现持久基因沉默

将NovaIscB的紧凑尺寸（614 aa）和优化后的ωRNA变体（166 nt）结合起来，意味着可以将融合蛋白和ωRNA表达盒打包到一个单一的AAV载体中，这为体内递送提供了极大的便利。研究人员利用肝脏嗜性的AAV血清型8，将携带OMEGAoff（基于dNovaIscB）以及靶向小鼠Pcsk9启动子的ωRNA的载体注射到小鼠体内。Pcsk9基因与胆固醇调节密切相关，是潜在的治疗靶点。

注射剂量为每只动物2×10^11总病毒颗粒。以靶向Rosa26基因的引导RNA作为阴性对照。在注射后采集血液样本，测量血清PCSK9蛋白和总胆固醇水平。

结果令人振奋：从注射后第3周开始，接受Pcsk9靶向引导RNA的小鼠血清PCSK9水平显著下降。这种下降持续了长达6个月的观察期。类似地，从注射后第4周开始，血清总胆固醇水平也出现了显著下降，并持续了整个研究期间，其降低幅度与临床上使用的PCSK9单克隆抗体所达到的治疗效果范围相似。

为了评估OMEGAoff的毒性，研究人员在6个月时间点测量了血清总胆红素（bilirubin）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平，这是肝脏功能的重要指标。结果显示，Pcsk9靶向组与未注射组、PBS处理组以及Rosa26靶向对照组相比，这些指标没有发生显著变化，提示在该剂量下，OMEGAoff系统在体内具有较好的安全性。

此外，在人类细胞中的RNA测序分析也显示，OMEGAoff能够以高度特异性的方式抑制靶基因，与CRISPRoff系统表现一致。这些体内外实验结果共同展示了利用OMEGAoff实现持久基因抑制和表观基因组编辑的巨大潜力。

未来：微型基因编辑工具的新篇章

总而言之，这项研究成功地结合了演化指导和结构引导的工程策略，从自然界中找到并改造了一个紧凑（614个氨基酸）的IscB蛋白——NovaIscB，并将其应用于构建紧凑的表观基因组编辑器OMEGAoff。

从活性最高的天然直系同源蛋白OrufIscB出发，通过插入并工程化来自相关蛋白（包括其他IscB和Cas9）的REC结构域，成功地增加了NovaIscB的有效引导长度，使其最优使用20 nt引导RNA。与野生型OrufIscB相比，NovaIscB实现了高达约40%的indel活性（提高了约100倍）。更重要的是，通过精心的REC环工程和ωRNA优化，NovaIscB在保持高活性的同时，其脱靶特异性也达到了与SpCas9和AsCas12f-YHAM等成熟系统相媲美的水平，显著优于早期的工程化OgeuIscB或eIscB。

NovaIscB的紧凑尺寸（614 aa）和优化后的ωRNA（166 nt）使其能够被打包到单一的AAV载体中，极大地促进了体内递送。研究人员展示了基于dNovaIscB的OMEGAoff系统在小鼠体内通过AAV递送，能够实现长达数月的持久基因抑制，并伴随表观遗传修饰。这不仅为体表观基因组编辑提供了新的高效工具，也为未来开发更紧凑、更安全的基因治疗方法奠定了基础。

当然，NovaIscB目前主要识别NTAAA TAM，这虽然能够靶向90%的人类基因进行敲除和93%的基因启动子区域进行转录调控，但未来扩展其TAM兼容性或提高对非规范TAM的靶向效率将使其应用更加广泛。同时，评估NovaIscB以及其他基于IscB的基因编辑工具在体内的免疫原性，是将其推向临床应用的关键下一步。

这项研究成功地将自然多样性筛选、结构生物学、蛋白质工程和深度学习预测相结合，创建了一个性能显著提升的IscB变体。这一策略不仅为优化基因编辑工具提供了范例，也为通过工程化改造天然酶类，用于分子生物学应用开辟了新的可能性。NovaIscB作为基因编辑工具箱中的新成员，有望在疾病研究、基因治疗等领域发挥重要作用，解锁更多生命科学的奥秘。