Nature Methods：解锁植物细胞壁“功能地图”！“碳标签”——活体感知软硬、酸碱与信号

为什么植物细胞壁这么“难搞”？传统方法瓶颈何在？

植物细胞壁是一个极端复杂的多糖网络，主要由纤维素（cellulose）、半纤维素（hemicellulose）和果胶（pectin）等构成，并嵌有糖蛋白（glycoprotein）和木质素（lignin）等。它的性质高度可变，需要既足够坚固以抵抗巨大的膨胀压力（turgor pressure），又足够柔韧以适应细胞生长和组织重塑。

研究细胞壁最直观的方式是荧光显微镜（fluorescence microscopy）。目前有一些荧光染料可以结合细胞壁的不同成分进行染色，比如常用的钙荧光白（Calcofluor White, CFW）和文艺复兴红（Renaissance SR2200, SR2200）结合纤维素，碘化丙锭（Propidium Iodide, PI）可以染色植物的细胞壁和核酸。然而，这些染料通常需要较长的孵育时间才能渗透到组织深处。在实验中，研究人员发现CFW和SR2200在孵育几个小时后才能清晰染色拟南芥（Arabidopsis thaliana）的根部表皮，但它们向组织深处的渗透非常有限。PI虽然也能染色细胞壁，但它对细胞具有明显的毒性。研究发现，用PI染色1小时后，染料开始进入细胞内部并染色细胞核，经过24小时暴露在CFW或SR2200中的拟南芥根部也出现了异常细胞肿胀等毒性迹象。这些毒性限制了它们在活体和长期成像中的应用。

另一种方法是使用针对细胞壁特定表位的抗体（antibodies），但这通常需要对植物组织进行固定和透化处理（permeabilization），这使得活体成像变得不可能。

基因编码的生物传感器（genetically encoded biosensors）是活体成像的有力工具，比如用于检测质外体（apoplast）钙离子、谷氨酸或pH水平的传感器。这些传感器通常是荧光蛋白（fluorescent protein），可以精确报告细胞内或细胞壁空间的离子浓度或pH值变化。但它们的局限性在于：需要通过转基因技术将传感器引入植物体内，这对于许多非模式生物来说，要么不可能，要么非常困难，限制了它们的应用范围。

总而言之，我们需要一种新的工具，它能：1）特异性地结合植物细胞壁；2）能够快速渗透到组织深处；3）对活体细胞毒性低；4）具有模块化特性，能够连接不同的荧光探针或功能分子；5）最好不依赖于转基因技术，适用于更广泛的植物物种。

灵感源于自然：神奇的“碳标签”（CarboTag）登场！

研究人员将目光投向了大自然。植物自身就懂得如何与细胞壁结合——它们利用硼酸（boric acid）作为细胞壁成分（主要是果胶）的交联剂（crosslinker）。硼酸通过与多糖中的二醇（diol）形成可逆共价键来结合细胞壁。然而，普通苯硼酸（phenylboronic acid）与二醇形成稳定复合物的最佳pH范围在7到9之间，而植物细胞壁的质外体通常是偏酸性的，生理条件下的pH范围在4到8之间，这使得普通硼酸在这类pH下结合较弱。

研究发现，吡啶硼酸（pyridinium boronic acids）可以在更低的酸性pH下形成更稳定的复合物。基于这一发现，研究人员设计并合成了一个小分子结构——“碳标签”（CarboTag）。它是一个吡啶硼酸衍生物，并且携带一个可点击的炔基（alkyne group）。这个炔基就像一个“接口”，可以通过点击化学（click chemistry）这种高效、特异、反应条件温和的化学反应，方便地与携带叠氮基（azide group）的荧光探针或任何其他叠氮基化的分子连接。

这种模块化的设计是CarboTag的核心优势。它意味着，我们只需要合成一次CarboTag这个“导航仪”，就可以通过简单的点击化学反应，将各种各样的“货物”（cargo）——无论是不同颜色的荧光染料，还是具备特定功能的生物分子或小分子探针——“装配”到细胞壁上，而无需为每一种货物重新设计整个分子。

快！准！狠！CarboTag的超能力测试

CarboTag是否真能满足我们的需求？研究人员进行了一系列严格的测试。

首先，他们将CarboTag与常用的绿色荧光染料AlexaFluor488连接，得到了CarboTag-AF488探针。将活体拟南芥幼苗用CarboTag-AF488染色30分钟后，探针就清晰地标记了根部细胞壁网络，甚至渗透到了组织深处。作为对照，未经修饰的AF488染料则完全无法有效染色细胞壁。通过质壁分离（plasmolysis）实验，研究人员进一步证实，CarboTag确实是特异性地靶向细胞壁，没有可检测到的膜插入现象。

接下来，他们将CarboTag的渗透能力与CFW、SR2200和PI这些传统细胞壁染料进行了对比。结果令人振奋：CarboTag-AF488在短短15-30分钟内就完全渗透到了拟南芥根部组织中，1小时内达到饱和染色强度。而CFW和SR2200即使经过几个小时的孵育，渗透深度仍然有限。正如前面提到的，PI不仅毒性高，而且其染色效率依赖于低渗环境（hypotonic medium），这会对植物组织造成渗透胁迫。更重要的是，经过24小时暴露在CFW和SR2200中的根部出现了明显的细胞毒性迹象，而CarboTag-AF488在相同条件下则没有。这表明CarboTag探针具有更快的组织渗透速度和更低的细胞毒性。

CarboTag的快速渗透是否意味着它与细胞壁的结合力较弱？为了解答这个问题，研究人员进行了荧光漂白恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）实验。FRAP测量荧光分子在漂白区域扩散恢复所需的时间，恢复越快通常意味着分子扩散越自由，结合力越弱。实验结果显示，在拟南芥根毛细胞中，CarboTag-AF488的荧光恢复半衰期（t1/2）显著长于CFW和SR2200。具体来说，CarboTag-AF488的半衰期约为360秒，而CFW约为80秒，SR2200约为60秒。这表明CarboTag与细胞壁的结合力实际上比CFW和SR2200更强。那么为什么它渗透更快呢？研究人员推测，这可能与CarboTag小分子、电中性的特性有关，使其更容易在细胞壁网络中扩散。

CarboTag的强大之处还在于它的普适性。研究人员发现CarboTag-AF488不仅能有效染色拟南芥，还能清晰标记多种植物物种的细胞壁，包括绿藻（Penium margaritaceum）、蕨类（Ceratopteris richardii）、苔藓（Physcomitrium patens）和地钱（Marchantia polymorpha）。这表明CarboTag所结合的细胞壁表位在这些物种中是保守的，即使它们的细胞壁成分存在显著差异。他们甚至成功地用CarboTag标记了拟南芥种子水合后周围富含果胶的粘质层（mucilage），揭示了其中复杂的纤维状结构。此外，CarboTag还能有效染色褐藻（brown algae）的细胞壁，如铜藻（Saccharina latissimi）和糖昆布（Saccharina latissidula），它们的细胞壁主要由藻酸盐（alginate）构成，缺乏果胶。CarboTag甚至能染色包含琼脂（agar）的培养基凝胶。这些结果共同指向了CarboTag的结合靶点可能是在水合状态下、二醇基团易于接近的多糖水凝胶（hydrogel），其中果胶、琼脂和藻酸盐都符合这一特征。

而CarboTag无法染色细菌（如大肠杆菌 Escherichia coli）和卵菌（oomycetes，如棕榈疫霉 Phytophthora palmivora）的细胞壁，这些生物的细胞壁成分与植物不同（细菌细胞壁含肽聚糖，卵菌细胞壁含纤维素），这进一步佐证了CarboTag对植物细胞壁特定成分（如果胶）的特异性。

模块化设计的优势体现在其光谱灵活性。通过将CarboTag与不同颜色、带有叠氮基的市售荧光染料结合，研究人员轻松构建了一系列覆盖可见光谱范围的细胞壁探针，如CarboTag-AF430（蓝绿色）、CarboTag-AF488（绿色）、CarboTag-sCy3（黄色/橙色）和CarboTag-sCy5（远红）。这些不同颜色的探针可以用于多重标记（multiplexing），例如同时标记细胞壁和基因编码的荧光蛋白（如标记肌动蛋白 ABD2-mCherry 或微管蛋白 MAP65-RFP），这对于研究细胞壁与细胞骨架等结构的相互作用至关重要。CarboTag探针也与高分辨率成像技术（如AiryScan）兼容，能够实现对细胞壁更精细结构的观察。

细胞壁的“软硬”秘密：CarboTag带你看孔隙

细胞壁不仅是静态的屏障，更是动态变化的结构。它需要在承受巨大膨胀压力的同时，允许细胞生长和扩张。这种机械特性的动态调节是植物发育的关键。那么，细胞壁的“软硬”或者说网络结构如何变化呢？

研究人员利用CarboTag开发了一种新的功能探针来探测细胞壁的孔隙度（porosity）和结构变化——CarboTag-BDP。CarboTag-BDP的核心是一个特殊的荧光团——BODIPY分子转子（molecular rotor）。这类分子在被光激发后会发生分子内旋转（intramolecular rotation），这种旋转是非辐射过程，会消耗能量，导致荧光寿命（fluorescence lifetime）降低。分子周围环境的粘度（viscosity）或空间阻碍越大，分子转子的旋转就越困难，荧光寿命就越高。因此，CarboTag-BDP的荧光寿命可以作为探测其所处细胞壁环境中分子运动受阻程度的指标，从而间接反映细胞壁，特别是果胶网络的孔隙大小和密度。在水溶液中（自由旋转），CarboTag-BDP的荧光寿命较低；而在粘稠或结构致密的环境中，荧光寿命较高。

研究人员将CarboTag-BDP应用于拟南芥幼苗，并进行荧光寿命成像（FLIM）。首先，他们通过抑制纤维素合成酶（cellulose synthase）来改变细胞壁组成。用纤维素合成抑制剂异恶草醚（isoxaben, ISX）处理拟南芥幼苗后，植物生长受阻，渗透敏感性增加。ISX处理已知会导致细胞壁去酯化果胶（de-esterified pectin）水平增加，并在某些情况下增加木质素（lignin），可能形成更致密的细胞壁网络。正如预测的，ISX处理的拟南芥细胞壁显示出显著更高的CarboTag-BDP荧光寿命，高于对照组。较高的荧光寿命指示分子内旋转受阻更严重，从而反映了抑制纤维素合成后细胞壁中果胶网络的密度增加。这些发现与之前的研究一致。在分析中，表皮最外侧的细胞壁因其独特的表面化学性质而始终表现出非常低的荧光寿命，可能存在荧光猝灭（quenching）效应，因此被排除在分析之外。

接下来，他们检测了细胞壁完整性（cell wall integrity, CWI）维持通路关键基因FERONIA（fer）的突变体。FERONIA是一种果胶结合受体激酶，在细胞壁完整性感知中发挥核心作用。fer突变体表现出细胞壁完整性受损，根生长加速，容易发生细胞破裂，对渗透胁迫高度敏感。通过FLIM成像，fer-2和fer-4突变体的细胞壁显示出显著较低的CarboTag-BDP荧光寿命，表明细胞壁孔隙度增加。特别是fer-4突变体，其荧光寿命分布范围更宽，反映了细胞壁孔隙结构的异质性（heterogeneity）更强。这些结果可能反映了fer突变体中果胶密度的降低和细胞壁不均匀性的增加。由于CarboTag-BDP探针在纳米尺度上对孔隙度敏感，这些变化可能是导致fer突变体机械缺陷的原因。

CarboTag-BDP的功能成像不仅限于根部。研究人员还绘制了地钱（Marchantia polymorpha）芽苞（gemmae）细胞壁的孔隙度图。他们观察到，芽尖分生组织（apical meristem）周围的年轻细胞壁比成熟细胞壁具有显著更高的荧光寿命，表明它们更致密。这与细胞分裂后富含果胶的细胞壁随着成熟逐渐富含纤维素并变得更加坚硬的认识相符。最后，他们利用CarboTag-BDP探测了拟南芥叶片气孔（stomata）保卫细胞（guard cell）的细胞壁孔隙度变化。气孔的开闭涉及保卫细胞的物理运动。在脱落酸（abscisic acid, ABA）诱导气孔关闭后，保卫细胞外壁的荧光寿命显著低于关闭前（p=0.00073）。较低的荧光寿命表明孔隙度增加。这生动地展示了气孔的运动如何涉及细胞壁可逆的物理变化。

酸碱的世界：用CarboTag测量细胞壁pH

植物细胞的生长离不开巨大的膨胀压力。根据“酸生长”理论（acid growth theory），细胞壁在细胞膨胀力的作用下发生屈服（yielding），这一过程由质外体酸化介导，酸化激活细胞壁松弛蛋白（expansins），从而增加细胞壁的伸展性。植物激素生长素（auxin）通过激活质子泵（proton pumps）等机制促进质外体酸化，调控细胞生长。病原体（pathogens）也常通过改变细胞壁pH来促进侵染。因此，测量质外体pH对于理解植物生长、发育和对环境的响应至关重要。

传统的质外体pH测量方法存在一些局限性。例如，常用的pH敏感荧光染料HPTS（8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid）不仅是pH报告探针，它本身也是一种潜在的光酸化合物（photo-acid），在激发光照射下会释放质子，从而改变测量环境的pH，甚至被报道具有细胞毒性。其他方法通常测量植物组织表面的pH，而非细胞壁内部的真实pH。基因编码的pH传感器虽然能测量细胞壁内部pH，但需要转基因且读数依赖于荧光强度，易受探针浓度和光散射伪影的影响。

研究人员将CarboTag与Oregon Green（OG）荧光染料结合，构建了FLIM-based的质外体pH传感器——CarboTag-OG。OG染料的报告pKa约为4.8，其荧光寿命会随pH变化而改变。体外实验显示，CarboTag-OG的荧光寿命随pH变化呈典型的S形曲线。重要的是，CarboTag-OG特异性靶向细胞壁，具有与CarboTag-AF488相似的染色动力学，而游离的OG染料则会进入细胞内部，没有明显的质外体定位。荧光寿命读数相较于荧光强度对探针浓度和光散射更不敏感，更适合复杂环境下的定量测量。

通过对拟南芥幼苗根部进行FLIM成像，研究人员发现根部不同区域的质外体pH存在差异。在根的伸长区（elongation zone），CarboTag-OG的荧光寿命低于根尖（root tip）和成熟区（maturation zone）。较低的荧光寿命对应较低的pH。根据体外pH-寿命曲线估算，伸长区相对于根尖分生组织（meristem）的pH变化幅度约为ΔpH -1.1，相对于过渡区（transition zone）的pH变化幅度约为ΔpH -0.4。这与酸生长理论中伸长区质外体酸化的认识是一致的。

为了进一步验证CarboTag-OG的pH响应性，研究人员将预先染色的拟南芥根部用天然生长素吲哚-3-乙酸（indole 3-acetic acid, IAA）或真菌毒素fusicoccin处理。IAA和fusicoccin均能激活质子泵，导致质子外排到质外体，引起质外体酸化。实验结果显示，在IAA或fusicoccin处理10分钟后，表皮-皮层细胞壁中的荧光寿命显著降低，低于未处理的对照组。根据曲线估算，IAA处理引起的酸化幅度约为ΔpH -0.22，fusicoccin引起的酸化幅度约为ΔpH -0.31。作为对照，用具有相似酸性和大小但无生物功能的苯甲酸（benzoic acid）处理则未引起荧光寿命下降（p=0.62）。这表明CarboTag-OG能够灵敏地报告细胞壁质外体的pH变化。

需要注意的是，由于植物细胞壁复杂的化学微环境与简单的缓冲溶液存在本质差异，体外测量的pH-寿命曲线不能直接用于精确定量活体细胞壁的绝对pH值。然而，CarboTag-OG作为一种FLIM探针，可以准确反映同一实验条件下不同区域或不同处理之间pH的相对变化，这对于研究细胞壁质外体pH的动态变化和功能响应仍然是非常有价值的工具。

细胞壁的“烽火台”：CarboTag追踪活性氧（ROS）

活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是植物中关键的信号分子，参与广泛的生理过程，包括发育、伤口响应和病原体防御。在植物防御中，ROS爆发是细胞感知病原体后最早的响应之一，ROS还能作为化学试剂，例如促进细胞壁中伸展蛋白（extensin glycoprotein）的交联。ROS在细胞溶胶（cytosol）、线粒体（mitochondria）或细胞膜（membranes）中的生成已有多种方法可以检测，但质外体中的ROS，尤其是病原体感知后在细胞壁中的ROS，却一直难以直接原位（in situ）检测。这正是ROS发挥交联功能以及感知病原体信号（通过修饰细胞壁蛋白的半胱氨酸残基）的关键位置。

为了开发质外体ROS报告探针，研究人员选择了氧化敏感探针BODIPY 581/591 C11。这个探针的核心是一个BODIPY结构，并连接了一个带有两个氧化反应位点的苯基丁二烯尾巴。在非氧化状态下，这个共轭体系发出红色荧光。氧化后，尾巴的共轭体系缩短，发射光谱向绿色移动。由于其疏水性，这个探针通常定位于细胞质膜上。

将BODIPY C11直接与CarboTag融合虽然能靶向细胞壁，但由于其两亲性（amphiphilic），仍存在明显的膜插入（membrane insertion）现象。为了减少膜插入、增加细胞壁定位的特异性，研究人员在CarboTag与探针之间引入了一个亲水性间隔臂（hydrophilic spacer）。由此得到的探针命名为CarboTag-Ox。这一改进有效减少了膜插入，根据质壁分离后的膜和细胞壁荧光强度估计，约70%的信号来自细胞壁。

为验证CarboTag-Ox的功能，研究人员首先将预染色的拟南芥植株暴露于通过芬顿反应（Fenton's reaction）在外源产生的ROS中。在暴露于ROS之前，探针纯粹发出红色荧光，指示几乎没有氧化发生。在随后的1小时内，他们观察到探针被ROS激活，首先在根尖出现信号，然后逐渐扩散到整个根部。这种红-绿强度比的增加清晰地指示了CarboTag-Ox的进行性氧化。

接着，他们用细菌鞭毛肽flg22处理植物。flg22是病原体的标志性分子，能被植物细胞膜上的FLS2（Flagellin Sensitive 2）受体感知，触发模式识别免疫反应（pattern-triggered immunity），其中包括ROS爆发作为防御机制。在flg22处理前，CarboTag-Ox探针几乎没有氧化信号。处理后，他们在表皮细胞中观察到明显的ROS产生信号，并且信号随时间扩散到根内部的皮层细胞。作为对照，未处理的根部只显示微弱的ROS传感器氧化信号。这些结果证明，CarboTag-Ox能够以活体整体成像的方式，在亚细胞分辨率下解析细胞壁中ROS作用的动态过程，响应病原体信号。

“碳标签”的未来：无限可能的探索

“碳标签”（CarboTag）的出现，为植物细胞壁的活体成像和功能研究带来了革命性的突破。它提供了一种简单、高效、毒性低且普适性强的细胞壁靶向策略。通过与不同荧光染料结合，CarboTag构建了一个覆盖可见光谱范围的细胞壁染料库，支持多色成像和与基因编码报告分子的联合使用。更重要的是，通过与功能敏感探针结合，CarboTag成功开发了能够量化细胞壁孔隙度、pH和ROS水平的报告探针，揭示了细胞壁在生长发育和环境响应中的动态功能变化。

CarboTag的模块化设计为其未来的扩展提供了无限可能。除了已报告的功能探针，研究人员可以想象将CarboTag与报告钙离子、其他离子种类或氧化还原状态的探针结合，构建更丰富的细胞壁功能成像工具。将CarboTag与生物活性分子结合，有望实现对特定细胞壁位点的信号传递或修饰，从而干预和研究细胞壁相关的生理过程。

虽然CarboTag探针在某些组织（如根冠、侧根原基、带厚角质层的芽苞和叶状体）的染色可能需要更长的孵育时间或优化条件，但其核心优势——小分子、低毒性、快速渗透和广谱适用性——使其成为研究活体植物细胞壁的有力工具。特别是它能够在不进行基因改造的情况下，应用于广泛的植物物种甚至褐藻，极大地拓展了细胞壁功能研究的范围。

结合长期延时成像（long-term time-lapse imaging）的能力，CarboTag有望用于绘制植物细胞壁在发育过程中物理化学变化的动态图谱。

总之，“碳标签”工具箱提供了一个全新的视角，让我们能够更深入地理解植物细胞壁这个复杂而动态的世界。随着更多基于CarboTag的功能探针的开发，我们期待看到更多关于细胞壁在植物生命活动中作用的精彩发现！