天工所开发AAV介导的碱基编辑疗法，改善视网膜色素变性小鼠表型，校正效率高达49%

近日，在 Nature Communications 上发表了一项研究，研究人员利用携带 RP 致病突变的 rd10 小鼠模型，证明通过双 AAV 系统递送腺嘌呤碱基编辑器可纠正神经视网膜中的致病单核苷酸变异（SNV），且效率高达 49%。中国科学院天津工业生物技术研究所的毕昌昊、张学礼，以及上海交通大学医学院附属上海人民医院眼科的万晓玲和孙晓东为本文共同通讯作者。

（来源：Nature Communications）

研究人员表示，“我们构建并验证了治疗人类视网膜病变的转化治疗方案。这一发现可能会加速基于碱基编辑的基因疗法的发展。”

开发 AAV 介导的碱基编辑疗法，校正效率高达 49%

杆状磷酸二酯酶（PDE6）在光传导级联中起着至关重要的作用。编码 PDE6（PDE6B）β 亚基的基因突变是常染色体隐性 RP 的常见病因，据估计全球每年新增病例 36,000 例。

针对这种单核苷酸变异（SNV）引起的遗传性疾病，新一代 CRISPR 技术——碱基编辑 (BE) 技术能够直接、不可逆地纠正碱基突变。

与标准基因组编辑相比，BE 可以有效修复碱基突变，而不会出现双链 DNA 断裂（DSB），从而减少目标位点插入或缺失的发生。

在这项研究中，研究人员以 rd10 小鼠为研究对象。rd10 小鼠携带 Pde6b 基因的错义突变（c.1678C>T, p.R560C），与典型人类 RP 患者的表型相似，是先进治疗测试中最受欢迎的模型之一。

前面提到，RP 患者的病变是视杆细胞变形到死亡的过程。为了阻止这一过程，已经开发了有前途的基因增强疗法。不过，该疗法仍有不足之处，一是人工基因增强不太可能达到最佳的平衡蛋白质水平；二是过程中引入的 DNA 表达可能会随着时间的推移而降解。

这些问题可以通过直接基因编辑来解决。

在这项工作中，研究人员利用 BE 技术来纠正 rd10 小鼠的致病性突变，并使用 AAV 进行递送，该技术已在许多基因增强临床试验中采用，显示出良好的安全性。

▲图丨设计并优化用于校正 rd10 SNV 的 ABE8 系统（来源：Nature Communications）

与前人研究相比，采用 BE 技术和 AAV 递送是这项研究中的优化策略。

此前，已有研究人员使用 CRISPR/Cas9 来纠正 rd10 小鼠体内的 SNV，然而，这种方法可能不适合临床应用。与标准的 CRISPR/Cas9 方法不同，BE 介导靶向单核苷酸转换，而不涉及 DSB 和 HDR（同源定向修复） 途径。

还有研究人员利用慢病毒载体递送的碱基编辑器，成功纠正了 Leber 先天性黑蒙（LCA）2 型 rd12 小鼠模型中的 Rpe65 突变，成功恢复了视觉功能，这项工作具有里程碑意义。然而，由于慢病毒系统的安全性问题，这些策略在应用于人类患者时可能具有挑战性。

▲图丨双 AAV SpRY-ABE8e 处理可恢复 rd10 小鼠的 PDE6B 蛋白表达（来源：Nature Communications）

在本研究中，光学显微镜的观察结果显示，与未经处理的薄而退化的外核层（光感受器）相比，经处理的区域保留了厚而坚固的外核层。且该疗法纠正神经视网膜中的致病性 SNV 的效率高达 49%。经处理的 rd10 小鼠的眼睛能检测到大量视网膜电图信号，而对照组则信号极少。水迷宫实验（The water maze experiment）表明，治疗大大改善了视觉引导行为（vision-guided behavior）。

更具临床意义，持久性需进一步研究

论文中指出，这项研究从两个方面为这一课题增添了新的信息。

第一，提供了一种更具临床意义的途径。大多数 RP 基因都优先甚至专门在杆状光感受器中表达，这项研究中，RPE65 在视网膜色素上皮细胞中表达，支持 BE 技术在临床上的广泛应用。另外，基于 AAV 的基因疗法的安全性和靶向性已在基础研究和临床试验中得到充分验证。

▲图丨ABE 处理后 rd10 小鼠体内 PDE6B 蛋白的恢复情况（来源：Nature Communications）

第二，BE 治疗的持久性还需要进一步研究。该研究的初步数据显示，该疗法的持久性可达到治疗后 2.5 个月（P90）。研究中观察到，P90 时治疗区域的视网膜层为 3-4 行，这与同一只眼睛的未治疗区域形成鲜明对比，未治疗区域只有一排不连续的视网膜仍然存在。

然而，研究人员也观察到治疗反应的下降。P90 时的视网膜厚度约为 P35 时的 60%，在所有光照强度下，暗视 ERG b 波振幅降至 P35 时的 50%以下。

文中指出，目前尚不清楚这种下降的根本机制。研究人员分析，可能的原因包括 BE 的持续表达和/或免疫反应，以及 rd10 小鼠先天性超敏感光依赖性感光细胞死亡，其细胞基础尚未完全了解。

“就临床应用而言，理想的治疗方法既需要高水平的有益反应，又需要长期的持续时间。BE 技术的治疗应用尚处于早期阶段，我们希望我们的初步纵向数据能够启发未来开发更持久方法的研究提供启发。”

文章强调，除了持久性之外，在将 AAV 介导的 BE 疗法引入人类患者之前，还需要作出进一步的努力。

“首先，目前尚不清楚哪种 AAV 血清型对光感受器的 BE 最有效，特别是在双 AAV 载体的递送方面，这需要进一步研究。新出现的工程 AAV 载体可能提供比 AAV5 更好的选择。”

“此外，由于目前的研究只测试了一种剂量（1×109GC/eye），因此非常有必要进行详细的剂量反应测试，以确定体内 BE 活性的动力学特征。”

“研究结果最终将为人体试验的剂量外推提供依据。此外，使用光感受器特异性启动子，例如 RHO，可以通过限制视杆细胞中 BE 的表达来增强治疗的安全性和功效。”