《自然》子刊：苏州大学团队构建“特洛伊木马”工程菌，穿透血脑屏障，直捣胶质母细胞瘤

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见也最致命的原发性脑肿瘤类型，目前，针对GBM的治疗手段主要有：手术切除、放疗和替莫唑胺化疗等等[1,2]。尽管这些治疗手段的使用已相对成熟，但GBM的治疗效果仍不容乐观，例如，GBM的复发几乎是普遍存在的，另外，GBM患者的生存率也仍旧非常低。

在GBM治疗所面临的诸多挑战之中，最为棘手的一点就是现有的给药系统无法绕过血脑屏障（BBB），而BBB本身对于大多数药物又都是不渗透的。因此，开发一种能有效透过或绕过血脑屏障的高效给药方法就成为了治疗GBM的关键。

近日，来自苏州大学功能纳米与软物质研究院的何耀教授和王后禹研究员团队在《自然·通讯》上发表了一项重要的研究成果[3]，通过构建装载有葡萄糖聚合物和光敏ICG纳米硅颗粒的细菌，实现了对血脑屏障的跨越和对肿瘤的靶向，最终，通过激光照射诱发的光热效应，有效地杀伤了肿瘤细胞，并延长了携带GBM小鼠的生存期，为脑肿瘤的治疗提供了一种新的可行性方案。

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由于血脑屏障的存在，一般的治疗手段很难对GBM这样的脑部肿瘤产生较好的疗效，为了进行更有效的治疗，此前已有多种侵入性的方法被提出，包括脑深部刺激、脑内移植、直接注射、鞘内脑输送等等。然而，侵入性的治疗方法往往存在较大的风险且会给病人带来巨大的痛苦，这使得人们对于有效的非侵入性疗法的需求愈发迫切。

在现有的非侵入性治疗策略中，本文的研究对象——纳米颗粒，由于其良好的载药效率、可时空控制的药物释放和治疗过程的可视化等优良特性，正受到越来越多研究人员的关注和青睐。然而，纳米颗粒的一些性质，如颗粒大小和表面电荷性质等等，仍大大限制着其在包括GBM在内的脑肿瘤治疗中的应用。

另一方面，某些细菌的特性，如肿瘤特异性靶向能力、良好的肿瘤组织穿透性和基因包装能力使其有望被改造为合适的载药系统。此外，值得注意的一点是，一些细菌已被证明可通过跨细胞、细胞旁和/或位于受感染的吞噬细胞中等途径穿过血脑屏障。总之，基于这些特性，研究人员开发了使用工程细菌作为递送载体的纳米颗粒疗法。

这样，借助这一“特洛伊木马”（工程细菌载体），就可以将士兵（纳米颗粒）悄悄地输送到敌军的大本营，并对GBM进行一场致命的内部打击。

图1 “特洛伊木马”细菌的工作原理

首先我们讲讲“特洛伊木马”中最核心的“士兵”分子的构建原理，这一过程主要可分为两步：

①利用硅纳米颗粒（SiNP）表面的氨分子与葡萄糖多聚物（GP）的醛基间发生的席夫碱反应将GP偶联在SiNP上；

②通过GP与吲哚箐绿（ICG）间的静电吸附，构成GP-ICG-SiNPs颗粒。

图2 GP-ICG-SiNPs分子的构建过程

作者利用光谱学分析和显微观察等手段对其理化性质进行了一系列的验证。在诸多性质之中，最为关键的一条是GP-ICG-SiNPs颗粒会在808nm激光照射300s的条件下升温至64℃，这正是“士兵”分子得以杀伤肿瘤的关键。

图3 激光照射下GP-ICG-SiNPs纳米颗粒的光热效应

构建好“士兵”分子后，研究人员要考虑的就是如何把“士兵”装入“木马”中。在这里研究人员使用了两种兼性厌氧菌——大肠杆菌（Escherichia coli 25922, EC）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium VNP20009, VNP）作为载体，再利用其能通过细菌特异性ATP结合盒（ABC）转运体途径内化纳米分子的特性，将GP-ICG-SiNPs颗粒引入细菌中，最终就构建出了所谓的“特洛伊木马”细菌。

经验证，研究人员发现，所构建的“特洛伊木马”细菌（Trojan EC与Trojan VNP）与普通的EC和VNP在形态特征和细胞周期等方面均无太大差异，这说明，GP-ICG-SiNPs分子的引入，并不会影响两种细菌的正常生理活性。

图4 纳米颗粒的引入不会影响“特洛伊木马”细菌的正常生理特征

为了对“特洛伊木马”细菌的杀伤能力进行初步验证，研究人员首先进行了一系列的体外实验。首先，在光热效应方面，在808nm激光照射400s后，Trojan EC和Trojan VNP两种细菌均升温至55℃，略低于上述提到的相同剂量激光处理下游离GP-ICG-SiNPs的温度（64℃）。

扫描电镜观察结果表明，在55℃下，细菌已经出现了严重的破裂，同时，活死细胞染色实验结果也印证了这一点，即“特洛伊木马”细菌具有良好的光热活性，在激光照射下纳米颗粒升温能有效地诱发细菌破裂。

图5 激光照射下纳米颗粒升温导致的细菌破裂

在研究人员的构想中，细菌临近癌细胞破裂释放的肿瘤相关抗原和细菌本身破裂产生的细菌残骸都能够诱发机体的免疫应答反应。

为了验证这一猜想，研究人员设计了一个transwell细胞共培养系统，在transwell的上室中，作者将各种细菌（EC、VNP、Trojan EC、Trojan VNP）与胶质母细胞瘤细胞系G422细胞共培养，在下室中，则培养了由小鼠骨髓中提取来的树突状细胞（DCs）。共培养一段时间后，通过流式细胞分析（通过CDC11c+、MHCII+含量）来评估DCs细胞的成熟水平。最终结果表明，经激光照射处理的“特洛伊木马”细菌和G422共培养物能有效提高下室中DC细胞的成熟水平。

图6 “特洛伊木马”细菌的体外功能验证

进一步实验中，为了验证“特洛伊木马”细菌能透过血脑屏障，研究人员又设计了另一套transwell共培养系统，在transwell小室中先培养一层来自人脑微血管内皮细胞（HBMEC）以模拟血脑屏障，然后再将“特洛伊木马”细菌接种于上室中，通过测量跨上皮细胞电阻（TEER）来评估血脑屏障的完整性，再按照不同时间分别从下室中收集培养基进行CFU测定来评估细菌的跨血脑屏障渗透率。

结果表明，与EC或VNP共培养后，HBMEC BBB模型的TEER值保持相对稳定，这说明，EC或VNP不会影响血脑屏障的完整性。而CFU测量结果显示，EC和VNP的跨血脑屏障渗透率随时间推移而逐渐增加（4h时，Trojan EC和Trojan VNP分别增加至49.7%和60%）。相同结果在小鼠脑微血管内皮细胞构建的BBB体外模型中也得到了验证。

图7 对“特洛伊木马”细菌穿透血脑屏障的体外验证

在体外模型中简单验证后，研究人员进一步对“特洛伊木马”细菌在体内的表现进行了评估。通过对经过尾静脉注射后不同时间点的小鼠进行组织匀浆破碎和稀释培养，研究人员发现，在最初的阶段，所注射的细菌主要在肝脏中富集，随着时间推移，肝脏中的细菌数量逐渐降低，而脑组织中的细菌数量则逐渐升高。

研究人员推测，这种差异的出现，可能是细菌在缺氧、免疫抑制且具有一定独特理化性质的胶质母细胞瘤微环境中发生选择性增殖造成的。

之后，在进一步实验中，研究人员还通过体外构建三维培养多细胞球状体（MCSs）和对尾静脉注射小鼠GBM组织进行切片验证了“特洛伊木马”细菌对GBM组织的浸润能力。实验结果表明，“特洛伊木马”细菌能够有效的渗透到小鼠GBM组织的内部。

图8 “特洛伊木马”细菌在小鼠体内能够穿过血脑屏障并渗透进GBM组织内部

基于Trojan EC和Trojan VNP对血脑屏障的穿透能力以及对GBM的靶向和渗透能力，研究人员进一步研究了“特洛伊木马”细菌治疗原位携带GBM小鼠的实际效果。在注射细菌12h后，脑内ICG的荧光信号达到峰值，在这时对小鼠进行808nm激光照射5min后，注射Trojan EC和Trojan VNP的小鼠的GBM表面温度分别升高到50.7℃和51.7℃。

之后，研究人员又提取了脑肿瘤和周围的淋巴结进行组织匀浆及流式细胞分析，结果发现，光热处理显著促进了GBM内CD8T细胞的激活，这说明，“特洛伊木马”细菌内纳米颗粒的光热效应有效的激活了适应性抗肿瘤免疫。另外，研究人员还发现，光热处理也增加了GBM内NK细胞和巨噬细胞的含量，以及提高了组织内IFN-γ和TNF-α的水平。

总之，激光照射诱发了“特洛伊木马”细菌内纳米颗粒的升温，最终导致细菌和周围临近GBM细胞发生热解破碎，产生的细菌残骸和释放的肿瘤相关抗原有效地激发了先天性或适应性免疫反应，进而抑制了肿瘤的生长。

图9 “特洛伊细菌”诱导的光热免疫治疗

总的来说，本项研究巧妙地利用了兼性厌氧型细菌能够穿透血脑屏障并特异性定植在GBM肿瘤内部的特点，将其开发为药物递送的有效载体，再结合纳米颗粒光热诱发这样的非侵入性新型治疗手段，最终实现了对GBM的高效杀伤，这为包括GBM在内的多种脑肿瘤的治疗提供了新的思路和方向。未来期待这一疗法的进一步改进和临床实验能为广大癌症患者带来更多的惊喜。

参考文献：

[1]Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 2005;352(10):987-996.

[2]Perry JR, Laperriere N, O'Callaghan CJ, et al. Short-Course Radiation plus Temozolomide in Elderly Patients with Glioblastoma. N Engl J Med. 2017;376(11):1027-1037.

[3]Sun R, Liu M, Lu J, et al. Bacteria loaded with glucose polymer and photosensitive ICG silicon-nanoparticles for glioblastoma photothermal immunotherapy. Nat Commun. 2022;13(1):5127. Published 2022 Sep 1.