Nature Methods：从序列到结构——RhoFold+深度学习模型实现RNA 3D预测的高效革命

RNA分子因其高度的灵活性和复杂的折叠模式，给通过实验手段获取其高分辨率的三维结构带来了巨大挑战。尽管X射线晶体衍射、核磁共振光谱（NMR）和冷冻电镜等实验技术在RNA结构解析方面取得了一定进展，但这些方法的高成本、低通量以及对RNA样本的苛刻要求，限制了它们在大规模RNA结构研究中的应用。因此，计算机预测方法成为RNA 3D结构研究的必要补充。

传统计算预测方法主要分为模板法和能量采样法两类。模板法依赖于已有的RNA结构模板数据库，如ModeRNA和RNAbuilder，但其应用受限于数据库中模板的数量和多样性。而“de novo”预测方法，如FARFAR2、3dRNA和SimRNA，虽然具有更强的预测潜力，但因需要大量计算资源进行结构采样，难以有效应对RNA结构的多样性和复杂性。AlphaFold在蛋白质结构预测中的成功激励了研究人员将深度学习应用于RNA 3D结构的预测，但RNA结构数据的匮乏和多样性为这一任务带来了额外的挑战。

RhoFold+的创新与突破

针对上述挑战，研究团队开发了基于语言模型和深度学习方法的RhoFold+，旨在高效、精确地预测单链RNA的三维结构。RhoFold+通过大规模预训练的RNA语言模型（RNA-FM）提取序列特征，并结合深度学习模块，采用端到端的方式实现RNA 3D结构的预测。该模型在精度和计算效率上均优于现有的其他预测方法，展示了显著的创新和突破。

RhoFold+的架构及其性能评估所使用的任务（Credit: Nature Methods）

RhoFold+的架构：图a展示了RhoFold+的架构，这是一个完全自动化的端到端方法，旨在从序列出发预测RNA的三维（3D）结构。该方法利用一个RNA语言模型（RNA-FM），该模型基于23,735,169个未注释的RNA序列进行预训练。此外，RhoFold+包含多个深度学习模块，其中包括一个IPA模块，该模块用于建模RNA分子的3D位置。通过这些模块，RhoFold+能够在大约0.14秒内生成有效且相对精确的RNA 3D结构（无需MSA搜索）。

数据预处理步骤：图b展示了RhoFold+的数据预处理步骤，旨在从PDB数据库中提取所有可用的非冗余单链RNA 3D结构。此外，图中提到IFE（集成功能元素）用于支持RNA的功能研究。RhoFold+在多个挑战中被广泛基准测试，例如RNA-Puzzles目标和CASP15自然RNA目标，同时还应用于所有可用的实验确定的RNA 3D结构。

性能评估：RhoFold+在交叉验证实验中表现出很高的准确性，并且在跨家族和跨类型验证实验中展示了对未见RNA结构的良好泛化能力，尤其是在处理新确定的RNA结构和未见过的RNA家族和类型时。数据拆分评估表明，RhoFold+并未过拟合其训练集。此外，RhoFold+还能够预测次级结构和对结构工程设计有用的参数。

RhoFold+的技术架构

RhoFold+由多个模块组成，涵盖了数据预处理、特征提取、结构预测和结果优化等步骤。

RNA语言模型（RNA-FM）

RNA-FM是一个包含12层Transformer的深度学习语言模型，负责对输入RNA序列进行特征提取。通过对约2370万个RNA序列进行大规模预训练，RNA-FM能够捕捉RNA分子的复杂进化关系和序列特征，生成高质量的序列嵌入（embedding）。

RNA-FM基于庞大的RNA数据集进行预训练，使其具备了广泛学习RNA结构特征的能力，即使面对未见过的RNA序列也能有效推断其结构特性。大规模预训练使RNA-FM能够捕捉RNA中的长期相关性，从而显著提高下游任务的预测精度。

Rhoformer模块

Rhoformer是一个12层的深度学习模块，负责对RNA-FM提取的特征进行进一步处理。通过10次循环迭代，Rhoformer不断优化结构预测结果，逐步提高预测的精度。

实验结果表明，多次迭代的Rhoformer可以显著减少预测误差。在RNA-Puzzles评估中，与其他对比方法相比，Rhoformer的多次迭代将预测误差降低了23%，展现了其在结构优化中的显著效果。循环迭代的设计还帮助模型逐步收敛，确保生成的结构符合RNA的物理和生物学合理性。

结构模块和IPA模块

结构模块由8层深度学习单元组成，主要用于生成RNA的局部原子坐标并计算扭转角度，从而预测RNA的全原子坐标。而IPA（Invariant Point Attention）模块则确保RNA分子的相对空间位置保持一致，提升预测结果的物理合理性。

IPA模块的引入显著提升了RNA结构预测的精度。实验表明，IPA模块能够有效减少均方根偏差（r.m.s.d.）15%，确保局部结构与整体空间构象的一致性。点不变性注意机制使得RNA分子在折叠过程中保持正确的空间关系，确保预测结果更具生物学意义。

数据预处理与过滤

研究团队从蛋白质数据银行（PDB）中提取了13,379个RNA链的三维结构数据（截至2022年4月13日）。通过CD-HIT工具对数据集进行聚类，使用80%的序列相似性阈值，最终得到782个代表性RNA序列用于训练。为了提高模型的泛化能力，数据预处理步骤中采用了严格的过滤标准，包括筛除分辨率高于4.0 Å的结构，长度限制在16至256个核苷酸之间，以及移除与蛋白质结合的RNA。

数据过滤和聚类显著增强了模型的泛化能力。与未经处理的数据集相比，经过数据预处理后的模型在交叉验证中的TM评分提高了约12%。CD-HIT聚类有效降低了数据冗余，确保了训练集的代表性，从而提高了模型应对不同RNA类型的适应性。

挑战与评估

RhoFold+在RNA-Puzzles和CASP15等挑战中接受了广泛评估。RNA-Puzzles评估表明，RhoFold+在17个RNA目标中达到<5 Å的均方根偏差（r.m.s.d.），并且在24个目标中有23个目标的精度超过其他方法。在CASP15测试中，RhoFold+在所有六个自然RNA目标上的平均r.m.s.d.为8.92 Å，显著优于其他对比方法。

RNA-Puzzles和CASP15的评估结果证明了RhoFold+的可靠性和精确性。特别是在复杂RNA结构的预测方面，RhoFold+优于其他基准模型，其在对多结构域RNA分子的预测中展现出了显著优势，能够更好地捕捉不同结构域之间的相互作用。

RhoFold+在多项挑战中的表现，包括RNA-Puzzles和CASP15评估（Credit: Nature Methods）

RMSD性能表现： 图a显示了RhoFold+与其他方法在24个非冗余RNA-Puzzles目标上的均方根偏差（r.m.s.d.）散点图。每个点代表特定方法的预测模型，表明RhoFold+在多个目标上的表现优于其他方法。

训练集依赖性和泛化能力： 图b展示了RNA-Puzzles目标7和38的对齐情况，并与最相似的训练结构进行了比较，表明RhoFold+并未对训练集过拟合，也没有简单地复制与目标最相似的结构。

TM得分与LDDT的回归关系： 图c展示了RhoFold+预测的TM得分和局部距离差异测试（LDDT）与所有训练序列中最大序列相似性之间的回归关系，进一步评估了其预测的泛化性能。

运行时间比较： 图d显示了RhoFold+与其他方法在运行时间上的比较。RhoFold+在典型RNA-Puzzles预测中完成结构生成的时间约为0.14秒，相比其他方法有显著的速度优势。

最佳模板对比： 图e将RhoFold+的预测与训练集中最好的单个模板进行了比较，显示RhoFold+在大多数RNA-Puzzles目标上能够取得更好的预测效果。

对CASP15自然RNA目标的评估： 图h显示了RhoFold+对CASP15自然RNA目标的详细性能比较，粉色列记录了详细的r.m.s.d.值，蓝色列记录了结构GDT-TS和TM得分的Z分数之和，展示了RhoFold+在多项CASP15自然RNA目标上的优异表现。

与其他顶尖方法的比较： 图i对RhoFold+的平均表现与CASP15小组及其他公开发表方法的平均表现进行了比较，显示RhoFold+在大多数目标上取得了相当或更好的预测精度。

结构GDT-TS与LDDT与序列长度的回归图：图j展示了RhoFold+在所有CASP15目标上的结构GDT-TS（Global Distance Test - Total Score）和LDDT（Local Distance Difference Test）与序列长度之间的回归关系。回归分析显示，随着序列长度的增加，GDT-TS和LDDT值会有所变化，但整体来看，RhoFold+对较长RNA序列的预测表现保持了一定的准确性。

与AIchemy_RNA2和UltraFold在CASP15 R1116目标上的对比：图k比较了RhoFold+与AIchemy_RNA2和UltraFold在CASP15 R1116目标上的表现。在这个比较中，虽然RhoFold+的r.m.s.d.为8.92 Å，相对于其他方法略高，但其预测的整体拓扑结构更为精确，显示出更高的TM得分（>0.55）。而AIchemy_RNA2在该目标上出现了错误的茎堆叠预测，导致r.m.s.d.高达17.26 Å，TM得分约为0.49。

RhoFold+潜在的失败案例：图l展示了R1156目标的RhoFold+预测，其中涉及了错误的堆叠模式和方向。这个案例突显了RhoFold+在某些目标上的局限性，特别是当遇到RNA连接区域和多样构象时，RhoFold+可能会出现错误的结构预测。

模型的性能验证

RhoFold+通过交叉验证、跨类型验证和盲测等多种方式验证其泛化能力和预测性能。

交叉验证

研究团队采用十折交叉验证评估RhoFold+的泛化性能，结果表明模型在各个验证集上的表现保持高度一致，平均TM评分达到0.57，高于FARFAR2等传统方法的0.41和0.44。

十折交叉验证证明了RhoFold+在不同RNA结构预测上的稳定性。这种验证方法有效地证明了模型在未见数据上的预测能力，而不仅仅是对训练集的拟合。此外，RhoFold+在处理不同序列变异和非典型RNA结构方面展现了稳定性，这对于理解RNA分子的进化具有重要意义。

跨类型与跨家族验证

RhoFold+在跨类型和跨家族的RNA结构预测中表现良好，包括tRNA和miRNA等不同类型的RNA分子，其TM评分高达0.73，说明模型具有很强的普适性。

跨类型与跨家族验证表明RhoFold+在处理多样性RNA结构方面的出色性能。尤其在生物多样性丰富的RNA类型上，RhoFold+展现了高度的适应性和预测精度。这使得RhoFold+能够广泛应用于各种RNA功能类型之间的预测，具有重要的科研和应用价值。

盲测与新结构测试

研究团队将RhoFold+应用于新发布的RNA 3D结构，作为盲测样本。结果显示，RhoFold+的平均r.m.s.d.为7.74 Å，优于DeepFoldRNA的8.54 Å，进一步验证了其在未知RNA结构上的优越预测能力。

盲测是检验模型泛化能力的关键标准。RhoFold+在盲测中的出色表现表明其不仅能适应已有的数据，还能够有效应对从未见过的RNA序列结构。特别是在对多样性RNA分子的预测中，RhoFold+展示了对未知结构的高精度适应能力，为RNA功能研究和新结构发现提供了有力支持。

 RhoFold+的优势与未来应用

高效的计算速度：在RNA-Puzzles的评估中，RhoFold+能够在约0.14秒内完成RNA结构的预测，这显著快于其他如SimRNA和FARFAR2的方法，使得RhoFold+特别适用于大规模RNA结构预测任务。高效的计算速度是模型实用性的重要衡量标准。RhoFold+的高效计算能力意味着其可以在基因组范围内应用于RNA结构的系统预测，例如在RNA疫苗和RNA靶向药物设计中，RhoFold+显著提高了工作效率。此外，其高效性使其在RNA数据库扩展和功能注释中具备重要的工具价值。

精确的次级结构预测：RhoFold+除了预测RNA的3D结构，还能精确预测RNA的次级结构。在次级结构预测测试中，RhoFold+在ArchiveII数据集上的F1评分达到0.936，显著高于UFold的0.909。RNA的次级结构对其生物功能至关重要。RhoFold+在次级结构预测上的优异表现，说明其在识别RNA内部互补配对和二级结构特征方面具备显著优势。这对于理解RNA的功能机制、特别是长链RNA（如lncRNA）的调控作用非常重要。

矫正实验结构的能力：RhoFold+还具有识别和矫正实验结构中错误的能力，如晶体结构中的假二聚体（domain-swapped dimers）。在ZTP核开关和THF核酶等实例中，RhoFold+通过分析实验数据有效地校正了这些结构误差。实验结构数据中的误差可能严重影响对RNA功能的理解，RhoFold+通过识别并校正这些误差，使预测的结构更接近生物的真实状态。这对基于RNA结构的药物设计和功能分析至关重要。尤其是对于RNA-蛋白质复合物中RNA的精细结构校正，RhoFold+提供了更高的精度，确保与蛋白质相互作用的区域的准确性。

IHA的预测与构建设计：RhoFold+能够准确预测RNA分子中两个螺旋之间的相对角度（IHA, Interhelical Angles），从而为RNA纳米结构的设计提供支持。在预测3SUH结构时，RhoFold+识别并校正了由晶体结构引起的错误，使得IHA的预测结果更加符合生物学实际。IHA参数对RNA纳米结构的稳定性至关重要。RhoFold+在IHA参数预测中的成功应用，展示了其在合成生物学和纳米技术中的巨大潜力，尤其是在设计需要精准控制螺旋角度的RNA纳米装置时，其提供了有力的支持。对于RNA折叠（RNA origami）等领域，RhoFold+的IHA预测使得构建更加复杂且稳定的RNA结构成为可能，为生物纳米材料的开发带来了新契机。

RhoFold+的开发标志着RNA 3D结构预测技术的重大进步。通过结合大规模预训练的RNA语言模型、深度学习架构以及高效的数据预处理流程，RhoFold+显著提高了RNA结构预测的精度和效率。其在RNA次级结构预测、实验数据校正以及RNA纳米结构设计等方面的出色表现，为RNA生物学研究和相关应用开辟了新途径。

未来，随着RNA生物学的进一步发展，RhoFold+及其后续版本有望在RNA功能解析、RNA靶向药物开发及新型生物材料设计等方面发挥更为关键的作用。RNA的功能与结构多样性远超我们的想象，RhoFold+为解锁这些复杂性提供了强大的工具和新颖的视角，这无疑将为RNA生物学以及广泛的生物医药领域注入新的动力与活力。