清华大学陈春来/刘俊杰团队揭示CasX靶标搜索和切割过程的动态调控机制

清华大学生命科学学院/北京生物结构前沿研究中心陈春来课题组与刘俊杰课题组合作，在 Nucleic Acids Research 期刊发表了题为：Conformational dynamics of CasX (Cas12e) in mediating DNA cleavage revealed by single-molecule FRET 的研究论文。

该论文细致表征了CasX从非特异性结合到找到靶点并完成切割的动态过程，揭示了其独特的机制。

利用供体（Cy3）标记的sgRNA和受体（Cy5）标记的DNA，研究者通过单分子FRET实验捕捉到CasX蛋白在切割过程中依次呈现的3种构象状态：R-loop起始状态、R-loop形成后非靶标链（NTS）切割状态和靶标链（TS）切割状态（图1）。此外，还定量分析了sgRNA与DNA的匹配度如何影响CasX在DNA上的稳定性和切割活性，为基于CasX的基因编辑和调控工具的设计提供了重要依据。DpbCasX和PlmCasX在切割特异性上的差异，源于它们在结合DNA及切割过程中的动力学差异；而两者在切割过程中FRET模式的不同，则归因于它们在DNA上切割位点的差异。

图1. DpbCasX结合及切割全匹配DNA的构象动态

在本文中，研究者还提出了“有效靶标搜索效率”这一新的概念，用以衡量Cas蛋白在接触靶标后的有效识别效率。数据显示，CasX的有效靶标搜索效率（仅10%）远低于Cas9和Cas12a（50%-80%）。这意味着，CasX需要尝试约10次才能成功识别靶标位点，细胞内复杂环境可能进一步降低其搜索效率，从而导致其在细胞内较低的编辑活性。这一发现为未来优化CasX以及其他Cas蛋白提供了新视角。

最后，研究者构建了CasX识别与切割DNA的动态模型（图2）。CasX在搜寻靶点时与DNA短暂非特异性结合（Nonspecific binding），在动态搜索过程中识别PAM序列（PAM recognition），开始形成R-loop结构（R-loop initiation），然而，相较于SpCas9、AsCas12a和LbCas12a， CasX在这一步的效率低5-8倍。识别PAM后，CasX依赖充足的PAM近端匹配驱动R-loop形成，并利用单一的RuvC结构域活性中心依次切割NTS和TS（R-loop formation and NTS cleavage，TS cleavage），最后释放切割产物（DNA fragment release）。CasX独特的NTSB结构域在DNA解旋和R-loop形成中发挥了重要功能。这一动态模型深化了我们对CasX工作机制的理解，并为CasX以及其他Cas蛋白的优化和改造提出了新的思路和策略。