Nature：突破性发现！CREM揭示CAR-NK细胞“疲惫”之谜，抗癌效力有望飙升

免疫细胞的“疲惫开关”：CREM的意外发现

这项研究始于一个大胆的疑问：在CAR-NK细胞执行抗肿瘤任务时，它们的基因表达发生了怎样的变化？研究人员深入分析了在小鼠肿瘤模型中过继转移后的CAR19-IL-15 NK细胞的单细胞转录组数据（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）。这些细胞被输注到淋巴瘤小鼠体内，在清除肿瘤的过程中，发现了一个基因的表达量显著升高——那就是CREM。

研究发现，在体内输注后，CAR-NK细胞的CREM表达量显著升高，与输注前相比，在第7天和第14天，平均表达量分别增加了约2.5倍和约3倍，且这种升高与小鼠体内肿瘤控制的改善呈正相关。这似乎在暗示CREM与CAR-NK细胞的抗肿瘤活性密切相关。但更深入的分析却揭示了其复杂性：这些CREM高表达的CAR-NK细胞，不仅表现出如颗粒酶B（GZMB）和溶细胞素（GNLY）等效应基因的升高，暗示它们正在积极攻击肿瘤，同时也伴随着如TIGIT、KLRG1等抑制性检查点基因的表达上调，这通常与免疫细胞的“疲惫”或功能受损相关。这表明，CREM可能参与了CAR-NK细胞在激活状态下的平衡调控，既有激活的印记，也伴随着功能失调的信号。

为了进一步探究CREM在肿瘤免疫中的普遍性，研究人员分析了来自TISCH2数据库的肿瘤浸润NK细胞（tumor-infiltrating NK, TI-NK）数据。惊人地发现，在多种癌症类型中，TI-NK细胞的CREM表达量普遍高于外周血单核细胞（PBMC）中的NK细胞。特别是在膀胱癌、胆管癌和肺癌中，TI-NK细胞的CREM表达量显著增高。更有趣的是，在胰腺癌患者的转移性TI-NK细胞中，CREM的表达量达到了最高水平，甚至在差异活跃的转录因子调控网络中排名前50位。这些数据强烈暗示，CREM在肿瘤微环境中的高表达可能与NK细胞的功能受损有关，甚至在某些情况下，高CREM表达与患者不良预后（如低级别胶质瘤、肺腺癌、胃腺癌和乳腺浸润性癌）相关。这进一步强化了CREM作为免疫检查点的潜在角色。

研究人员还利用质谱流式细胞术（mass cytometry, CyTOF）对NK细胞的表型进行了深入剖析。研究显示，高表达CREM的CAR-NK细胞（特别是CAR70-IL-15 NK细胞）同时伴随着激活标志物（如NKG2D、CD25、CD2、GZMB和Perforin）和抑制性标志物（如NKG2A、LAG3、TIGIT和TIM3）的更高表达。这一发现进一步佐证了CREM的诱导可能与NK细胞的“激活诱导性疲惫（activation-induced exhaustion）”表型密切相关，它在介导抗肿瘤活性的同时，也可能启动了负反馈调节机制。

“点火器”的秘密：CAR激活与IL-15如何诱导CREM

既然CREM如此重要，那么它究竟是如何被CAR-NK细胞激活的呢？研究人员深入研究了CAR活化信号和IL-15细胞因子信号对CREM表达的影响。

当CAR-NK细胞与靶抗原（CD70）结合时，CREM的表达量在CAR70 NK细胞中显著升高，与未转导的NK细胞或缺乏胞内信号域的CAR-NK细胞相比，CREM mRNA表达量可增加约6倍。这明确指出，CAR分子内部的ITAM（Immunoreoreceptor Tyrosine-based Activation Motif）信号在CREM诱导中扮演了关键角色。

IL-15作为CAR-NK细胞疗法中常用的促增殖和持久性细胞因子，也展示了其对CREM的强大诱导能力。IL-15能够以剂量依赖的方式（从50 pg/mL到5000 pg/mL）显著增加CREM的表达，其诱导强度甚至高于等剂量的IL-2。当CAR激活与IL-15刺激同时存在时，CREM的表达量呈现出叠加效应，这意味着这两种信号通路可以协同作用来诱导CREM。CREM mRNA的表达在IL-15刺激后6小时即可上调，并在24-48小时达到峰值，在96小时内回到基线，显示出其转瞬即逝的诱导特性。而在持续分泌IL-15的CAR-IL-15系统中，CREM则持续高表达。

除了CAR和IL-15，研究人员还测试了其他常见细胞因子和内源性NK细胞受体对CREM表达的影响。结果显示，IL-2、IL-12和IL-18也能剂量依赖性地诱导CREM表达，其中IL-15的诱导作用最强。此外，通过抗CD16、抗NKp30和抗NKp46抗体激活NK细胞内源性受体，也同样能上调CREM表达。这表明，CREM的上调是NK细胞活化的一个普遍特征，由细胞因子和ITAM信号共同驱动，并且其强度和动力学特征因刺激类型而异。

机制揭秘：PKA-CREB轴的“幕后推手”

既然CREM在NK细胞活化中如此重要，那么其信号通路是怎样的呢？研究深入剖析了CREM诱导的分子机制，揭示了PKA-CREB信号轴的关键作用。

CAMP信号通路在细胞中扮演着重要角色，而CREM正是其关键调控因子之一。当细胞内CAMP水平升高时，蛋白激酶A（PKA）会被激活，进而磷酸化转录因子CREB和CREM。这些磷酸化的转录因子结合到CAMP反应元件（CAMP-response elements, CREs）上，调控靶基因的转录。研究证实，这一经典的PKA-CREB轴在CAR-NK细胞活化中发挥了核心作用。

具体而言，CAR激活能够导致CAR70 NK细胞中CREB的显著磷酸化（pCREB），但这种磷酸化在未转导或缺乏胞内信号域的CAR-NK细胞中不明显。这意味着CAR分子的CD3ζ链信号在诱导pCREB中至关重要。更有力的是，当预处理NK细胞，使用PKA抑制剂H89或钙螯合剂EGTA时，CAR诱导的CREB磷酸化和CREM诱导都被强烈抑制了。这与之前T细胞受体（TCR）信号下游PKA磷酸化CREB的发现不谋而合。

IL-15同样能以剂量依赖的方式增加PKA活性和pCREB水平，且H89和EGTA也能有效阻断IL-15诱导的CREB磷酸化和CREM表达。这有力支持了PKA-CREB轴在CAR激活和IL-15刺激介导的CREM上调中扮演的关键角色。

研究人员还通过染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）和定量PCR（qPCR）实验，进一步证实了pCREB能够强烈结合CREM启动子（CREM promoter 1），其结合强度与CREM的转录水平呈正相关。这表明CREM很可能是一个直接被CREB调控的靶基因。

值得注意的是，IL-15还通过JAK-STAT通路激活NK细胞，特别是STAT3和STAT5。数据显示，IL-15能够剂量依赖性地增加pSTAT3和pSTAT5，其中pSTAT5表现出更高的敏感性。虽然STAT3和STAT5也参与了CREM的诱导（STAT3或STAT5的缺失部分降低了CREM表达），但CREM的诱导在CAR激活后仍能独立于STAT信号发生，主要依赖于PKA-CREB轴。这揭示了CAR-NK细胞中CREM调控的双重机制：通过PKA-CREB信号轴和IL-15下游的STAT3-STAT5通路。

解除“封印”：CREM删除后的CAR-NK细胞威力大增！

既然CREM在NK细胞活化中扮演了复杂的角色，那么，删除CREM是否能提升CAR-NK细胞的抗肿瘤能力呢？研究人员运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在CAR-NK细胞中特异性敲除了CREM。

在体外实验中，CREM缺失（CREM KO）的CAR-NK细胞展示出显著增强的细胞毒性。无论是长期的二维培养、三维肿瘤球体（tumor spheroid）培养，还是肿瘤再挑战实验中，CREM KO的CAR-NK细胞都表现出更强的杀伤能力。例如，在针对UMRC3细胞的球体杀伤实验中，CREM缺失的CAR70-IL-15 NK细胞在第5天时能够将肿瘤球体的平均绿色图像强度降低至对照组的约20%，而野生型细胞仅能降低至约40%，显示出更有效的肿瘤抑制能力。这种增强效应在低效应-靶细胞比率（effector-to-target ratio）下尤为明显，且无论肿瘤细胞是否表达靶抗原CD70，CREM的缺失都能提升IL-15分泌型NK细胞的效应功能，表明CREM作为IL-15或CAR信号下游的一个通用抑制性检查点。

体外效力的提升在体内模型中得到了更有力的验证。在侵袭性CD70阳性Raji伯基特淋巴瘤小鼠模型中，与野生型CREM CAR70-IL-15 NK细胞、未转导NK细胞或未治疗对照组相比，接受CREM KO CAR70-IL-15 NK细胞治疗的小鼠肿瘤控制效果显著增强，并最终改善了小鼠的生存率。具体而言，CREM KO组小鼠的肿瘤负担在第14天时仅为野生型组的约20%，生存期显著延长（p值小于0.0001）。此外，CREM KO还促进了CAR-NK细胞在外周血（在第10天和第20天，CAR+ NK细胞数量分别是野生型组的约2.5倍和约2倍）以及肝脏、肺、骨髓和脾脏中的增殖和浸润。

在转移性CD70阳性乳腺癌PDX模型（patient-derived xenograft, PDX）中，接受CREM KO CAR70-IL-15 NK细胞治疗的小鼠，其肺部和肝脏的肿瘤负担显著降低，且CAR-NK细胞在这些器官中的增殖和浸润也显著增加。在胰腺癌小鼠模型中，腹腔注射CREM KO CAR.TROP2-IL-15 NK细胞也显著改善了肿瘤控制并延长了细胞的体内持久性。

更重要的是，这些增强的抗肿瘤效果并没有以牺牲安全性为代价。在多个小鼠模型中，CREM KO CAR-NK细胞的治疗耐受性良好，小鼠体重保持稳定，且主要器官的组织学分析未显示明显的毒性或异常。这为CREM作为CAR-NK细胞疗法的潜在治疗靶点提供了坚实的证据。

深度剖析：CREM如何重塑CAR-NK细胞的“命运”？

CREM删除为何能带来如此显著的疗效提升？研究人员通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和转录组测序（RNA-seq）深入探究了CREM对CAR-NK细胞的转录和表观遗传重编程机制。

转录重编程：从“疲惫”到“火力全开”

研究发现，CREM作为一种转录因子，能够直接结合到基因组上的多个位点。在CREM敲除后，CAR-NK细胞的基因表达发生了显著变化。与野生型CREM CAR70-IL-15 NK细胞相比，CREM KO导致了：

效应基因的上调：如颗粒酶B（GZMB）和干扰素-γ（IFNG）的表达显著升高，这些是NK细胞执行杀伤功能的核心武器。

NK细胞发育转录因子的上调：如KLF7和RUNX2，这些因子与NK细胞的成熟和功能密切相关。

疲惫和应激相关基因的下调：如BTG1、DUSP2、SMAD3和RGS1，这些基因通常与免疫细胞的功能受损和应激反应有关。

通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA），发现CREM敲除显著上调了对NK细胞效应功能和代谢至关重要的通路，包括MYC靶点V1（MYC targets V1）、E2F靶点（E2F targets）、MTORC1信号通路（MTORC1 signaling）和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）。同时，它下调了免疫抑制性通路，如缺氧（hypoxia）和TGFβ信号（TGFβ signaling）。这些发现共同指向一个结论：CREM通过直接结合并调控基因表达，促进了NK细胞的功能失调和疲惫状态，而CREM的缺失则逆转了这一过程，使CAR-NK细胞能够保持更强的抗肿瘤活性和增殖能力。

表观遗传重编程：解除染色质的“枷锁”

研究人员进一步通过转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）分析了CREM对CAR-NK细胞表观遗传景观的影响。在与肿瘤细胞共培养时，野生型CREM CAR70-IL-15 NK细胞的染色质可及性（chromatin accessibility）降低，这表明基因组变得更加“紧密”，不利于基因的表达。然而，CREM KO的CAR70-IL-15 NK细胞即使在肿瘤微环境中，也能够维持更加开放的染色质景观。这意味着CREM的缺失使得与免疫细胞激活、代谢和效应功能相关的关键基因区域更容易被转录机器接触到，从而促进了这些基因的表达。

具体的分析显示，CREM KO的CAR-NK细胞在与肿瘤细胞共培养时，在多种细胞代谢和效应通路（包括MTORC1、PI3K-AKT-MTOR信号通路和有丝分裂纺锤体）相关的基因位点上保持了更高的染色质可及性。此外，AP-1复合体（AP-1 complex）成员（如JUN相关因子）、STAT家族和CEBP家族转录因子的结合基序（motif）在CREM KO细胞中显著富集，这些转录因子是NK细胞活化和功能的重要调控者，其可及性的增加预示着细胞激活能力的提升。

代谢重编程：更强的“动力引擎”

除了转录和表观遗传的改变，CREM的缺失还显著改善了CAR-NK细胞的代谢健康。通过海马线粒体功能分析（Seahorse assays），发现CREM KO的CAR70-IL-15 NK细胞展示出增强的糖酵解能力（glycolytic capacity），并有增加线粒体呼吸（mitochondrial respiration）的趋势。这意味着这些细胞拥有了更强的“动力引擎”，能够更有效地产生能量以支持其抗肿瘤功能和持久性。

CREM——CAR-NK疗法的新靶点

这项开创性的研究首次确立了CREM作为CAR-NK细胞活化中的一个关键转录检查点。揭示了CAR激活和IL-15信号通过PKA-CREB信号轴共同诱导CREM，而CREM的过度表达则可能导致NK细胞的激活诱导性疲惫。更重要的是，通过基因编辑敲除CREM，成功地“解除”了CAR-NK细胞的“封印”，使其抗肿瘤效力显著增强，且不增加毒性。

这一发现为CAR-NK细胞免疫疗法开辟了全新的策略。未来的研究还可以着重于：

开发CREM特异性抑制剂：直接靶向CREM或其信号通路，以期在临床上增强CAR-NK细胞的抗肿瘤活性。

优化CAR-NK细胞设计：将CREM的敲除或抑制整合到CAR-NK细胞的制备流程中，以期获得更高效、更持久的抗肿瘤细胞产品。

深入理解CREM异构体功能：CREM有多种异构体，不同异构体的功能可能存在差异，进一步研究其特异性功能可能带来更精准的调控策略。

CAR-NK细胞疗法正以惊人的速度发展，成为对抗癌症的强大武器。而CREM的发现，如同在迷雾中点亮了一盏明灯，指引我们更深入地理解NK细胞功能调控的复杂机制，并为开发下一代更有效、更安全的CAR-NK细胞疗法提供了崭新的靶点和无限可能。