Nature Biotechnology | 突破质谱细胞术的瓶颈：ACE技术助力低丰度蛋白质检测

质谱细胞术(Mass Cytometry)是一种通过使用金属同位素标记的抗体来标记感兴趣目标的技术，能够在单细胞水平上同时测量数百万个细胞中的大约50种蛋白质或蛋白质修饰。然而，当前的质谱细胞术在灵敏度方面存在限制，通常需要数百个金属标记的抗体结合到每种细胞表位上才能达到仪器的检测阈值。这一限制阻碍了低丰度蛋白质组分的分析，包括许多在健康和疾病中起重要作用的转录因子、表面受体蛋白和细胞内磷酸化位点 。

为了克服质谱细胞术的灵敏度限制，研究团队开发了一种新型的信号放大技术，称为循环扩增放大(Amplification by Cyclic Extension, ACE)。该技术通过热循环DNA原位连接和3-氰基乙烯基咔唑(3-cyanovinylcarbazole, CNVK)磷酰胺的DNA交联来实现信号放大。

研究中使用了小鼠乳腺癌Py2T细胞，首先用4ng/ml的转化生长因子β1(TGFβ1)处理14天以诱导间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)，然后去除TGFβ1，使细胞在接下来的14天内回复到上皮状态(mesenchymal-to-epithelial transition, MET)。在这一过程中，在不同的时间点(0、1、2、3、6、9、14、17、21、24、28天)收集细胞样本。

循环扩增放大(Amplification by Cyclic Extension, ACE)技术及其应用的示意图（Credit: Nature Biotechnology）

ACE方法概述：图a详细描述了ACE方法的工作原理，包括初始标记、引物延伸、热循环和金属探针杂交等步骤。展示了如何通过多次热循环扩增引物链，从而显著放大每个抗体上的金属信号。

悬浮质谱细胞术中的应用：图b展示了ACE在悬浮质谱细胞术中的应用，说明ACE技术可以放大信号，使得低丰度标志物在质谱细胞术中的检测和定量成为可能。

成像质谱细胞术中的应用：图c展示了ACE与成像质谱细胞术(Imaging Mass Cytometry, IMC)结合的应用。图中显示了ACE技术在组织样本中的高灵敏度多参数空间分析，能够识别健康和病变组织样本中的细胞和组织区室。

循环扩增放大

初始标记：将靶向蛋白质的抗体首先与短DNA寡核苷酸引物(TT-a, 11-mer)结合。

标记应用：将结合了引物的抗体应用于细胞悬液，进行细胞表面或细胞内标记。

引物延伸：引入含有与引物互补的延伸寡核苷酸(a*-T-a*, 19-mer)，在适当温度下进行杂交，通过Bst聚合酶介导引物链的扩增。

热循环：通过多次热循环(每循环1分钟)，逐步延伸引物，形成数百个重复序列。

金属探针杂交：最后，将含有金属离子的探针与延伸后的引物杂交，从而显著放大每个抗体上的金属信号。

ACE技术在质谱细胞术中的验证和信号放大的定量结果（Credit: Nature Biotechnology）

HEK293T细胞验证：图a展示了使用绿色荧光蛋白(GFP)瞬时转染的HEK293T细胞来验证ACE放大方法的实验设计。通过对GFP表达的细胞进行ACE放大，与常规的荧光标记抗体和免疫SABER(免疫滚环扩增)放大进行比较，验证ACE的特异性和放大效率。

信号相关性：图b展示了ACE放大通过1至500次热循环的信号放大效果，并与传统的金属标记次级抗体进行比较。结果表明，ACE放大的GFP信号与次级抗体信号之间的Pearson相关系数在各个条件下均较高，验证了ACE在细胞内表位染色中的特异性。

信号增强和特异性：图c和d展示了通过不同热循环次数的信号增强效果。数据被分成10个等宽的区间，显示了每个区间的中位数在不同热循环次数下的变化。结果表明，前100个循环(大约2小时)内信号放大效率最高，之后放大效率逐渐下降。

放大强度和信噪比：图e显示了在500次循环放大中的信号强度和信噪比。结果表明，与未放大的对照相比，500次循环放大可实现13倍的放大强度和6倍的信噪比增强。

分支放大：图f展示了通过引入分支引物(a*-T-a*-b)进行进一步的信号增强。通过额外的热循环，分支放大显著增加了探测位点的数量，与线性放大相比，50次热循环分支放大可进一步实现9倍的信号增强，二次分支放大可实现额外5倍的信号增加，总计可实现500倍的初始信号放大。

正交性验证：图g和h展示了ACE放大体系中33个引物序列的正交性验证。通过对GFP抗体标记的HEK293T细胞进行单独染色、条形码标记和混合处理后，结果显示33个引物序列之间的平均串扰信号仅为1.02%，验证了ACE引物和探测器的高度特异性和正交性。

EMT和MET过程中的应用

通过使用ACE技术对小鼠乳腺癌Py2T细胞模型进行分析，研究团队能够高灵敏度地检测到在EMT和MET过程中发生的分子重编程。

Zeb1和Snail/Slug表达变化：在EMT过程中，Zeb1的表达在第6天后急剧增加，而Snail/Slug的水平在最初的3天内缓慢下降，并在第6天出现次级峰值。

细胞表型变化：在TGFβ1处理期间，上皮标志物E-cadherin、CK14、EpCAM和β-catenin的表达下降，间充质标志物vimentin和CD44的表达增加。相反，在TGFβ1去除后，这些标志物的表达发生逆转。

多重ACE技术在上皮-间充质转化(EMT)和间充质-上皮转化(MET)过程中，由不同转录因子表达水平引起的分子调控的分析结果（Credit: Nature Biotechnology）

实验流程：图a展示了实验的整体设计和流程。小鼠乳腺癌Py2T细胞被转化生长因子β1(TGFβ1)处理14天以诱导EMT，然后去除TGFβ1进行14天的MET逆转过程。在不同的时间点(0、1、2、3、6、9、14、17、21、24、28天)收集细胞，进行ACE标记和质谱分析。

降维分析：图b和c展示了使用统一流形逼近和投影(UMAP)方法对数据进行降维分析的结果。图b根据处理时间点对细胞进行颜色编码，图c根据测量标志物的丰度对细胞进行颜色编码。这些图显示了EMT和MET过程中细胞表型和分子特征的变化。

伪时间分析：图d展示了使用Scorpius伪时间分析方法对EMT-MET过程进行重构的结果。图中将伪时间与实际时间进行比较，发现分子定义的间充质表型在第6天开始出现，在TGFβ1刺激后9天完全消失。在MET过程中，具有上皮分子特性的细胞群体在14天的时间序列中逐渐扩展，而大部分细胞保持其间充质状态。

分子调控轨迹：图e展示了通过Scorpius分析测量标志物在EMT和MET过程中的分子调控轨迹。结果显示，Zeb1表达的增加发生在EMT后期，伴随着CK14的下调。在反向MET过程中，Zeb1表达的下降与波形蛋白(vimentin)表达的急剧下降相关，而E-cadherin水平的上升则在之前发生。

细胞群体特征：图f展示了在MET过程中，不同时间点Zeb1高表达、cyclin B1低表达的细胞群体与Zeb1低表达、cyclin B1高表达的细胞群体的双轴图。结果显示，Zeb1低表达、cyclin B1高表达的细胞群体在MET过程中逐渐增加。

标志物表达水平：图g展示了在Zeb1高表达、cyclin B1低表达的细胞群体与Zeb1低表达、cyclin B1高表达的细胞群体中，波形蛋白(vimentin)、E-cadherin和CK14的表达水平。结果表明，Zeb1和cyclin B1的表达水平与细胞的表型特征密切相关。

人T淋巴细胞信号网络的分析

通过ACE技术，研究团队能够高灵敏度地分析人T淋巴细胞信号网络的动态变化：

TCR信号传导：在抗CD3/抗CD28刺激下，TCR信号传导途径中的关键磷酸化位点(如p-CD3ζ, p-ZAP70, p-SLP76, p-ERK1/2)的信号显著增强，显示出强烈的信号传导响应。

免疫抑制分析：通过与手术后引流液(postoperative drainage fluid, POF)共同培养，发现POF1和POF2样品共培养导致TCR信号响应的减少和更短暂，说明这些样品具有免疫抑制特性。

多参数组织成像

ACE技术与成像质谱细胞术(IMC)结合，使得多参数组织成像分析成为可能：

肾脏组织分析：在对多囊肾病(polycystic kidney disease)患者的肾脏皮质组织进行分析时，ACE技术揭示了肾脏皮质中的六个主要区室，并展示了干细胞标志物nestin在这些区室中的异质性表达。

组织区室鉴定：通过IMC分析，能够识别和区分不同类型的肾小管、肾小球和血管区室，提供了详细的组织结构信息。

ACE技术通过显著提高质谱细胞术的灵敏度，为单细胞水平上低丰度蛋白质组分的分析提供了强有力的工具。这不仅拓展了质谱细胞术在生命科学研究中的应用潜力，还为相关疾病的研究和诊断提供了重要的技术支持。通过高灵敏度的多参数分析，ACE技术使得在单细胞层面上绘制低丰度蛋白质组分的图谱成为可能，为科学研究提供了新的视角和方法。