Nature Genetics：告别“批量”模糊——首个大规模单细胞研究，解码胶质母细胞瘤纵向演变的“个体差异”与“普遍规律”

进入“单细胞”时代：解码肿瘤生态系统的秘密

近年来，单细胞组学（single-cell genomics）技术取得了突破，让我们有机会以前所未有的分辨率去“窥探”肿瘤内部的每一个细胞。这项技术能够分别检测肿瘤中每个细胞的基因表达（通过单核RNA测序single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）或基因组变异（通过单细胞DNA测序）。

在这项新的研究中，研究人员正是利用了这种强大的工具，深入研究了GBM在接受标准治疗前（初发，Primary，T1）和复发后（复发，Recurrence，T2/T3）的演变轨迹。他们建立了一个名为GBM CARE（Glioblastoma Cellular Analysis of Resistance and Evolution，胶质母细胞瘤耐药性和演变细胞分析）的大型研究联盟，汇集了来自全球多家顶尖医院的59名GBM患者的肿瘤样本。对于这些患者，他们收集了初发和复发时的配对肿瘤样本，总共分析了121个肿瘤样本，并对其中约43万个细胞的单核RNA进行了测序，同时对肿瘤组织进行了批量DNA测序（WES/WGS）。

这项研究的独特之处在于其前所未有的规模（59对匹配样本）和多组学整合分析（单细胞转录组 + 批量基因组），这使得研究人员能够：1) 清晰地区分肿瘤中的恶性细胞和非恶性细胞；2) 详细刻画这些细胞在治疗前后的“身份”（细胞类型Cell Type）和“状态”（Malignant Cell State，即恶性细胞的不同转录组亚型）；3) 追踪肿瘤生态系统的整体“构成”（Composition）在治疗前后的变化；4) 探索基因组变异对细胞状态演变的影响；5) 最重要的一点，对比初发和复发样本，揭示GBM生态系统的纵向演变轨迹。

复发肿瘤的“新面貌”：恶性细胞退潮，脑神经细胞登场？

通过对这59对匹配的初发和复发GBM样本进行详细分析，研究人员发现了一些在肿瘤复发时普遍出现的“新面貌”。

其中最一致的变化发生在肿瘤生态系统的构成层面：相比于初发肿瘤，复发肿瘤中的恶性细胞比例显著降低。与此相对应的是，肿瘤微环境中的一些非恶性细胞，尤其是属于“胶质-神经”（glio-neural）类群的细胞，比例显著增加。这些细胞主要包括少突胶质细胞（Oligodendrocyte）、神经元（Neuron）以及星形胶质细胞（Astrocyte，ACs）。具体来说，研究发现，在66%的病例中观察到了这种恶性细胞比例降低和胶质-神经TME细胞比例增加的趋势。

为了验证这一发现，研究人员还分析了一个独立的、已发表的GBM单细胞数据集，结果也显示出相似的趋势：复发肿瘤中恶性细胞更少，而少突胶质细胞比例更高。

更有意思的是，这项研究根据肿瘤复发时的细胞构成（恶性细胞比例高低，以及低恶性细胞比例肿瘤中占主导的TME细胞类型）将患者分成了不同的组别。结果显示，那些在复发时表现为“低恶性细胞比例且胶质-神经TME占主导”（LMF-GN）的患者，在接受第二次手术后，生存时间显著长于其他组的患者（中位生存时间为19个月，而其他组为8个月，Log-rank检验 P = 0.012）。这提示我们，复发肿瘤的细胞构成可能与患者的预后息息相关，胶质-神经TME的富集或许预示着一个相对“温和”的复发类型。

恶性细胞的“百变状态”：没有统一的“剧本”

除了整体细胞构成的变化，恶性肿瘤细胞本身也具有高度的转录组异质性，表现为不同的“细胞状态”（cell states）。这项研究根据基因表达模式，将恶性细胞划分为了十种主要的状态，包括细胞周期（Cell Cycle）、星形胶质细胞样（AC-like）、间充质样（MES-like）、应激（Stress）、缺氧（Hypoxia）、神经祖细胞样（NPC-like）、少突胶质细胞祖细胞样（OPC-like）、分化神经元样（NEU-like）、胶质祖细胞样（GPC-like）以及纤毛相关状态（Cilia-like）。此外，研究还定义了三种与细胞状态比例无关的、反映肿瘤间异质性的“基线基因表达谱”（Baseline Profiles，BP），分别注释为胶质BP（Glial-BP）、细胞外基质BP（ECM-BP）和神经元BP（Neuronal-BP）。

先前一些基于批量测序的研究曾提出，GBM复发时常常发生从“神经祖细胞样”（proneural）到“间充质样”（MES-like）的转变。然而，这项大型单细胞研究却揭示了一个更为复杂的景象：在整个队列中，研究没有观察到任何一种特定的恶性细胞状态在复发时普遍富集。也就是说，GBM恶性细胞在治疗前后的“状态转变”并没有一个统一的“剧本”。

但需要强调的是，虽然没有统一的转变趋势，某些恶性细胞状态的存在确实与预后相关。例如，研究发现在复发肿瘤中，如果间充质样/缺氧（MES-like/Hypoxia）状态占主导，患者在第二次手术后的生存时间显著更短（中位生存时间为5个月，而其他恶性细胞状态占主导的患者为10.3个月，Log-rank检验 P = 0.00086）。这再次印证了肿瘤细胞状态对患者预后的重要影响。

个体轨迹的“迷宫”：千变万化的复发路径

如果从单个患者的角度来看，GBM的复发轨迹则更加“捉摸不透”。尽管群体层面显示了一些平均趋势（如恶性细胞减少），但当研究人员对比每一对匹配的初发和复发样本时，发现肿瘤的演变轨迹呈现出巨大的多样性。

数据显示，大多数样本对在细胞构成组别上发生了变化，高达68%的样本对从初发时的某种构成组别转变为复发时的另一种。同样，64%的样本对在主要的恶性细胞状态组别上发生了转变，56%在基线基因表达谱组别上发生了转变。研究甚至观察到了截然相反的演变轨迹，例如某个患者复发时AC-like细胞增加而GPC-like细胞减少，而另一个患者则恰好相反。

这种巨大的个体差异使得GBM的复发轨迹如同一个“迷宫”。尽管如此，这项研究发现，匹配的初发-复发样本对之间的转录组相似度仍然显著高于随机配对的样本。这意味着虽然路径多样，但同一患者的肿瘤在演变过程中保留了某种程度的“身份连续性”，它们之间的相似度仍然比随机选取的两个肿瘤更高。这提示我们，复发并非完全随机，而是初发肿瘤固有特征与治疗及微环境相互作用的结果。

拨开迷雾：谁在影响肿瘤的“变脸”？

既然复发轨迹如此多样，那么是否存在一些特定的因素，会影响GBM的演变方向呢？研究人员将目光投向了两种重要的“分子调节因子”（Molecular Modifiers）：MGMT基因的状态和治疗诱导的基因组变异。

首先是MGMT（O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶），它是一种DNA修复蛋白，其启动子的甲基化状态（MGMT promoter methylation status）与GBM对TMZ化疗的敏感性密切相关。MGMT启动子甲基化（MGMT-MET）的肿瘤通常对TMZ更敏感，患者预后也更好。这项研究发现，在MGMT启动子甲基化的初发肿瘤中，恶性细胞本身的MGMT基因表达水平显著低于非甲基化的肿瘤（P = 5.3 × 10⁻⁶）。研究进一步构建了一个模型，利用恶性细胞的MGMT表达水平来预测MGMT甲基化状态，发现这种基于表达水平的预测与患者手术间隔时间（衡量治疗反应的一个指标）的相关性更强。

更重要的是，恶性细胞的MGMT表达水平与肿瘤复发时的间充质样（MES-like）状态丰度显著相关。具体来说，在MGMT表达水平较低的肿瘤（通常对应MGMT-MET）中，复发时间充质样状态的丰度会降低；而在MGMT表达水平较高的肿瘤（通常对应MGMT-UM）中，复发时则表现出相反的模式，间充质样状态的丰度升高。间充质样状态通常与肿瘤的侵袭性、血管生成和耐药性有关，因此MGMT-low肿瘤复发时MES-like状态的减少，或许解释了MGMT-MET患者更好的预后。

其次是治疗诱导的基因组变异。研究发现，在复发肿瘤中，一些与DNA错配修复缺陷相关的突变信号（如COSMICv3 SBS签名中的SBS21）增加了，同时还有小片段插入/缺失（small insertion/deletion）的负担增加。研究特别关注了小片段缺失，发现有10例复发肿瘤表现出明显的small deletion phenotype。

有趣的是，那些获得small deletion phenotype的复发肿瘤，与缺氧（Hypoxia）和间充质样（MES-like）细胞状态的富集相关（paired Wilcoxon rank-sum test, P<0.05）。缺氧状态已知与GBM对放疗的耐药性有关。这提示我们，治疗诱导的基因组变异，尤其是小片段缺失，可能驱动肿瘤向更具侵袭性和耐药性的细胞状态演进。

总的来说，这项研究识别出两个关键的“分子调节因子”：恶性细胞的MGMT表达水平（与TMZ反应相关）和小片段缺失变异（可能与放疗相关），它们能够影响肿瘤复发时恶性细胞的状态演变轨迹。

生态的共舞：肿瘤细胞与微环境的协同演进

这项研究还强调了一个重要的概念：GBM的“生态系统”是协同演进的。也就是说，恶性细胞的变化与肿瘤微环境的变化并非孤立发生，而是相互关联、相互影响的。

研究发现，恶性细胞状态丰度的变化与TME细胞构成以及基线基因表达谱的变化之间存在显著关联。例如，恶性细胞的神经元样（NEU-like）状态与神经元基线表达谱密切相关，这种关联在复发肿瘤中可能增强。同时，胶质-神经TME中的少突胶质细胞和神经元表达的配体（如神经粘连素NLGN和神经调节蛋白NRG家族）被预测与恶性细胞的受体（如神经粘连素家族NRXN或ERBB4）相互作用，这种相互作用在复发时可能更频繁。这些发现支持了治疗后残余GBM细胞可能更深入地整合到脑实质中的假说。

这意味着GBM的复发不仅是恶性细胞自身的演变，也是其与周围微环境共同适应和改变的过程。恶性细胞的状态可能会影响它们与TME细胞的互动方式，而TME细胞的组成和分泌的信号也反过来影响恶性细胞的行为和状态。这种复杂的“共舞”共同塑造了肿瘤的复发。

绘制复发“导航图”：通往更精准的治疗

这项大型单细胞研究为我们描绘了一幅前所未有的GBM复发“蓝图”。它清晰地展现了GBM复发轨迹的巨大多样性和复杂性，挑战了以往某些过于简化的模型。虽然大多数轨迹是不可预测的“迷宫”，但研究成功地在这些“迷宫”中识别出了一些关键的“路标”和“岔路口”。

最普遍的变化是肿瘤生态系统的构成转变：恶性细胞比例下降，胶质-神经TME增加。这或许是一个积极的信号，并与更好的预后相关。同时，研究也揭示了恶性细胞状态转变的复杂性，没有统一的模式，但某些复发状态（如间充质样/缺氧）预示着更差的预后。

更重要的是，研究识别出了影响这些轨迹的关键分子调节因子：恶性细胞的MGMT表达水平和治疗诱导的小片段缺失。这些因素似乎能够“引导”肿瘤走向特定的演变路径（例如，MGMT-low与复发时MES-like状态的减少相关，小片段缺失与缺氧/MES-like状态的增加相关）。

这项研究的发现具有重要的临床意义。它提示我们，GBM复发是一个高度个体化的过程。理解每个患者肿瘤独特的演变轨迹以及驱动这一轨迹的关键因素，是实现精准治疗的关键。未来，我们或许可以利用单细胞技术和基因组分析，为复发GBM患者绘制个性化的“复发导航图”，根据肿瘤复发时的具体生态系统状态和潜在的演变驱动力，选择最有可能有效的治疗策略。

尽管GBM的复发轨迹复杂如迷宫，但这项研究利用前沿的单细胞技术，为我们点亮了迷宫中的部分路径，为最终征服这个顽固的“脑中恶魔”迈出了坚实的一步。未来的研究将需要进一步探索这些轨迹的详细分子机制，并开发能够针对特定复发亚型的创新疗法。